肝脏炎症是增加各类药物产生肝毒性的重要因素之一,但是在药物上市之前,临床上通常不对其进行评估,因此建立一种合适可靠的人类体外肝样模型对合理评价药物毒性十分关键。本研究利用了球形板体外3D培养技术,选用了三种人源化细胞分别为HepaRG细胞、肝星形细胞(HSC)以及肝库普弗(KC)细胞进行体外细胞共培养,保持HepaRG细胞和HSC数量相同,同时调节不同的KC细胞数量以建立三种体外3D共培养模型,分别命名为0%KCs、10%KCs(模拟人正常肝脏)和40%KCs(模拟人肝脏发炎),模型建成后对其进行17天的肝脏特异性功能的评价和细胞形态观察。结果显示,利用球形超低吸附培养板培养出来的3D肝脏小球,球体居中,形成球体的时间快,无需转移至新的培养板中且易于进行药物处理。建立的三种体外3D共培养模型均随着时间的推移而逐渐增大,直径最大可达到500-600μm,均能在17天内保持高水平白蛋白、总胆汁酸的分泌以及尿素的合成,表明我们在体外所建立的3D小球可以长时间保留肝脏的特异性功能。随后我们评估了3D小球中KC细胞的功能。脂多糖(LPS)是一种细菌内毒素,它可刺激机体产生白介素和肿瘤坏死因子等,从而产生炎症反应。因此我们选用浓度为1μg/mL的LPS诱导三种模型24 h后,检测了三种促炎细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β的分泌水平以及肝药酶(CYP3A4、CYP2B6)和P糖蛋白(Pgp)的基因表达水平。经LPS诱导前后,0%KCs模型的三种细胞因子无明显变化,10%KCs模型略微增加,40%KCs模型明显增加,其中TNF-α、IL-6明显增加,说明在共培养模型中添加的KC这种肝非实质细胞在炎症反应中发挥了关键作用。RT-PCR结果显示经LPS诱导炎症后,CYP3A4、CYP2B6表达均有所下调,导致活性降低,从而药物清除率下降。Pgp表达相对上调,导致模型产生耐药性。因此在接下来的药物毒性评价实验中,我们选用10%KCs和40%KCs这两种模型作为实验基础,探索不同肝毒性药物在肝炎症状态下的特点。我们选用了四种肝毒性药物分别为对乙酰氨基酚、异烟肼、盐酸胺碘酮以及苯妥英钠,并分别测试了这四种药物在LPS诱导炎症状态下的乳酸脱氢酶(LDH)释放、细胞活力(ATP)以及三种细胞因子的分泌。结果显示40%KCs模型具有更高的细胞因子释放、LDH的增加和ATP水平的降低。因此,在LPS诱导炎症下,40%KCs模型明显具有更强的细胞毒性。证明添加不同比例的KC细胞的关键性,在未来可以调节不同比例细胞数量用来评估人疾病状态下各类药物作用的特点,为将来新药上市之前所进行安全性评价提供新的方向。另外,我们也利用了这两种模型探究了氢化可的松(HC)对四种具有肝毒性药物的治疗情况。结果显示,四种药物在未添加HC之前,细胞因子释放浓度和LDH毒性均呈现剂量依赖性;添加HC治疗后,三种炎症因子和LDH毒性释放释放均明显下降。说明HC能通过抑制炎症因子的合成来减轻炎症反应,对两种模型都具有一定的抗炎效果。综上所述,我们建立了一种稳定并且能够在体外再现肝脏生理功能的,可用于研究肝脏炎症状态下不同类型肝毒性药物特点的有价值的体外3D肝脏模型,为未来高通量筛选病理状态下的药物肝脏毒性提供了新的平台。