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松江鲈(Trachidermusfasciatus Heckel)隶属于触形目(Scorpaeniformes),杜父鱼科(Cottidae),松江鲈属(Trachidermus)。历史上松江鲈分布较广,是我国渤海、黄海、东海沿岸及相邻淡水水域的习见鱼类。但自上世纪70年代以来,因为人们的过度捕捞,以及栖息地和繁殖地的严重破坏,其种群数量急剧降低。目前,松江鲈在我国许多水域已绝迹。松江鲈已列为国家二级保护动物。为恢复其自然种群,人工养殖势在必行。然而养殖过程中多种应激刺激的存在势必会引起各种疾病的出现和蔓延。只有深入开展松江鲈免疫机制的研究,才可以在人工养殖中采取有效的方法防治疾病,并且为养殖产量的提高提供长远的管理措施。凝集素通过介导蛋白质-碳水化合物的相互作用而成为动物先天免疫的重要组成部分,不仅参与病原体识别过程,同时也负责凝集细菌,固化细菌,激活补体,调理以及杀菌,甚至能够调节适应性免疫应答过程。面对水产养殖过程中日益增长的细菌、病毒、真菌以及寄生虫感染,考虑到各种凝集素不仅能够快速识别以及从体内清除病原菌,而且还能引发长期有效的适应性免疫,这激发了我们对松江鲈凝集素免疫作用的研究兴趣。本研究从松江鲈体内鉴定出三种凝集素(F型,C型,Galectin)和甘露糖结合凝集素相关的丝氨酸蛋白酶MASP,并对它们的特性和功能进行了较为全面而系统的研究,得到如下结果：1.一种含双结构域的半乳糖结合凝集素(Tfgal-9)参与松江鲈对细菌的免疫我们从松江鲈中克隆得到一个galectin-9,命名为TfGal-9。其cDNA全长1453bp,开放阅读框(ORF)900bp,编码299个氨基酸。TfGal-9含有两个串联的糖识别结构域(carbohydrate recognition domains, CRDs),每个结构域均包含2个保守的糖结合位点H-NPR和WG-EER.荧光实时定量PCR(qRT-PCR)分析表明,半乳糖结合凝集素广泛表达于松江鲈各组织,但在肠中表达最为丰富；其次是血、心、脑。LPS刺激后,在检测的五个组织(血液、皮肤、肝脏、胃和心)中,TfGal-9mRNA表达均明显上调。重金属刺激后脑TfGal-9表达显著上调。利用体外重组表达的TfGal-9蛋白研究其功能,发现TfGAL-9不依赖钙离子选择性凝集和结合部分细菌。管碟法检测得知TfGal-9i够抑制金黄色葡萄球菌(S. aureus)的活性。体外抗氧化实验表明TfGal-9对DPPH自由基具有清除能力。这些结果表明TfGal-9参与松江鲈对细菌的先天免疫,并具有抗氧化活性。这是迄今为止首次在鱼类对galectin-9的抗菌抗氧化活性进行研究。2.松江鲈补体的凝集素激活途径：TfCol-11及MASP的基因克隆与功能研究从松江鲈中鉴定的C-型凝集素collectin-11(TfCol-11)全长CDN序列开放性阅读框为795bp,编码264个氨基酸。它包含三个不同的区域：(1)含有典型的Gly-X-Y重复序列的胶原样区域；(2)颈区；(3)C-末端的CRD结构域,内含保守的可以结合甘露糖的Glu-Pro-Asn (EPN)基序。同时我们还克隆得到松江鲈MASP部分cDNA序列(包括96bp的5’非编码区共993bp),编码的氨基酸包含两个CUB结构域和一个EGF结构域(CUB-EGF-CUB)。RT-PCR研究发现TfCo1-11和MASP共表达于松江鲈肝脏,LPS刺激会引起二者在皮肤、血液、肝脏和鳃表达明显上调,值得注意的是两基因上调模式基本一致。利用原核表达系统获得TfCol-11和MASP重组蛋白。Ca2+存在条件F,TfCol-11可凝集兔红血细胞及多种细菌,且不依赖于Ca2+结合多种细菌。在体实验发现TfCol-11能够显著降低鳗弧菌(Vibrio anguillarum)引起的鲤鱼致死率。通过pull-down试验发现TfCol-11与MASP可以相互结合。根据这些结果推断TfCol-11可以激活松江鲈的补体系统,参与对细菌的免疫。3.松江鲈岩藻糖糖结合凝集TfFBL的基因克隆与功能研究本研究利用EST(表达序列标签)和RACE (cDNA末端快速扩增)技术从松江鲈中克隆一个F-型凝集素(TfFBL)。TfFBL的cDNA开放性阅读框为933bp,可编码310个氨基酸。TfFBL包含一个信号肽以及紧随其后的两个糖识别结构域。每个结构域含保守基序HX26RX5-6R。qRT-PCR分析显示TfFBL在卵中表达量最大,其次为皮肤、脾脏、肾脏、心脏和鳃。在受到LPS刺激后其表达量在血液、肝脏和皮肤中有明显的上调,其中在肝脏、血.液,LPS刺激后2h TfFBL表达可分别上调至正常的35.5、37.4倍。利用重组表达的TfFBL成熟肽,对其进行功能研究,发现TfFBL成熟肽可以不依赖Ca2+凝集和结合多种细菌,Ca2+存在条件下凝集的功能增强。岩藻糖抑制TfFBL对细菌的凝集,说明TfFBL可以结合岩藻糖。这些结果均表明TfFBL可作为模式识别受体参与松江鲈的先天免疫防御。