背景急性呼吸道感染(acute respiratory tract infection, ARTI)是在全球范围内人类最常见的传染性疾病之一,发病率居急性传染病的首位,平均每年下呼吸道感染导致大约4,000,000患者死亡。近些年来,非典、H5N1禽流感、猪流感、新型冠状病毒以及新出现的感染人的H7N9禽流感,让人类对呼吸道病毒性传染病的关注上升到一个前所未有的高度。ARTI也是威胁儿童健康的主要因素,造成每年大约2,000,000儿童死亡,已成为5岁以下儿童死亡的第二大病因,同时也是儿童主要的公共健康问题之一。面对当前呼吸道传染病防治的复杂形势,加强传染病疫情信息的监测报告和在人群中,尤其是儿童中,主动开展呼吸道病毒性病原体实验室监测,最大可能地对呼吸道传染病疫情进行预测预警,以期在疫情暴发流行早期及时发现并采取快速的应对措施,减少对社会和经济发展的影响。目的本研究在2009～2012年对ARTI儿童开展呼吸道病毒性病原体监测,主要包括呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)、鼻病毒(human rhinovirus,HRV)、流感病毒(influenza virus, IFV)、偏肺病毒(metapneumovirus, MPV),副流感病毒(parainfluenza virus, PIV)、人类博卡病毒(human bocavirus, HBoV),人冠状病毒(human coronavirus, HCoV)、人腺病毒(human adenovirus, HAdV),肠道病毒(human enterovirus, HEV),描绘在ARTI儿童中呼吸道病毒性病原体的病原谱和流行特征;分析呼吸道病毒在肺炎儿童和哮喘发作儿童中分布情况以及与重症的关系；分析呼吸道病毒在ARTI儿童中阳性检出率与气象因素的关系；了解呼吸道病毒之间以及呼吸道病毒与细菌之间的共生关系。本研究分析HAdV、HRV、HEV以及HBoV全基因组或某些基因片段变异进化特征,尤其是新发或再发的病毒亚型,主要包括HAdV-7、HAdV-55、HRV-C、 HEV-68.HEV-118和HBoV-1。通过对病毒基因特征的分析,了解该病毒的起源、进化、流行株及耐药等信息,从而为病毒感染治疗、疫苗研究和疫情控制提供科学依据和参考意见,进而保障人民生命健康安全,促进社会安定和经济发展。材料与方法以重庆医科大学附属儿童医院作为监测哨点医院,从2009年6月到2012年5月在呼吸内科开展急性呼吸道感染病例标本收集和呼吸道传染病监测。研究人员在ARTI儿童入院当天采集鼻咽抽吸物标本并使用统一标准问卷,收集病例信息。本研究共检测9种病毒性病原体,根据不同病原体采用相应的检测方法。IFV和HRV/HEV采用Real-Time PCR检测；RSV、PIV、HCoV、MPV(?)(?)HBoV采用巢式PCR检测；HAdV则使用单轮PCR检测。HAdV阳性标本扩增测定hexon基因和fiber基因序列,并测定了HAdV-55全基因组序列。HRV阳性标本扩增测定VP4/2基因序列,HEV扩增测定5’NTR序列和VP1基因序列。HBoV阳性标本扩增测定全基因组序列。基因序列分析主要包括同源性分析、系统发育分析、重组分析、分子钟分析、选择压力分析和空间动力学分析。调查表数据使用EpiData3.0录入,建立数据库。所有数据统计分析均采用SAS9.3软件处理。结果1.呼吸道病毒概况(1)本研究共纳入因ARTI(?)住院的儿童2451例,RSV阳性标本检出率最高,为36.7%,其余依次为PIV23.3%、IFV19.6%、HRV/HEV18.4%、HBoV14.1%、 HAdV7.9%、MPV3.4%和HCoV3.1%。至少一种呼吸道病毒阳性检出率为80.3%。单一呼吸道病毒感染率为45.2%。复合感染病毒阳性标本861例,复合感染率为352%。(2} IFV在各年龄组均有较高的感染率,但与<6个月年龄组比,其他各年龄组感染率稍高,足其1.5-2倍。在≤5岁的儿童中,HAdV(?)誊染率随年龄增大而逐渐增大。男孩比女孩更容易感染IFV-B和1HRV/HEV, OR分别为2.19(95%CI：1.16-4.14)和1.28(95%CI:1.02-1.59)。 ARTI (?)儿童临床症状和体征主要包括发热、咳嗽、咳痰、腹泻,肺部湿罗音和呼吸增快。RSV-A容易导致呼吸困难(28.2%,P<0.001),而RSV-B容易导致较多的咳痰(88.1%,P<0.001)。IFV-A感染导致白细胞计数降低(P<0.05)；RSV和PIV-3感染导致嗜中性粒细胞百分比减少和淋巴细胞百分比和血小板计数增高(P<0.05)。(3)在HAdV感染的儿童中,嗜中性粒细胞百分比升高,淋巴细胞百分比降低,血小板计数也降低(P<0.05)。(4) Logistic回归模型结果表明,与无呼吸道病毒感染相比,呼吸道病毒感染未增高肺炎发生几率。RSV和HAdV感染较容易引起重症肺炎(OR=1.58,95%CI：1.08-2.30；OR=5.10,95%CI：3.17-8.21)。与无呼吸道病毒感染相比,RSV-B、IFV-A和HRV/HEV容易引发哮喘中重度发作,OR值分别为2.99(95%CI:1.28-6.97)、2.28(95%CI:1.01-5.15)和2.94(95%CI:1.35-6.41)。(5)呼吸道病毒之间和呼吸道病毒与细菌感染之间的相关系数Rij均小于0.30,表明呼吸道病毒之间、病毒与细菌感染并不存有共生或抑制关系。RSV与月平均气温、大气压以及太阳光照时数相关度强,而其他呼吸道病毒与气象因素相关度均在中度以下,表明重庆地区气象因素对除RSV以外的呼吸道病毒流行影响较小2.人腺病毒亚型分布及基因特征(1)在重庆地区,HAdV亚型主要包括HAdV-7型48.7%、HAdV-3型37.3%和HAdV-55型3.1%；其次还有HAdV-5型2.6%、HAdV-1型2.1%和HAdV-2型0.5%。(2)在2010年7月～2011年6月期间HAdV阳性检出率较高。在2010年8月之前,HAdV-3为优势亚型；而从2010年9月开始,HAdV-7演变为占主导地位的HAdV亚型。HAdV-7引起的临床症状比例高,尤其以呼吸困难与湿罗音为最高(P<0.05),并且住院时间较其他亚型长(P=0.002)。各亚型复合感染率从45.7%到100%不等,以HAdV-7为最低(P=0.044)。HAdV-7(?)(?)起重症疾病的几率是HAdV-3的3.52倍(45.7%vs.18.1%,95%CI:1.60-7.74,P=0.002)。(3)重庆地区HAdV-7型主要以7d2为主。HAdV-7型hexon基因序列同源性均在99.8%-100%。系统发育分析显示重庆地区hexon基因序列主要分布在7d2和7d两个分支。7d分支更容易引起重症肺炎(OR=2.50,95%CI：1.05-5.94)。HAdV-7型fiber基因同源性在99.7%～100%,存在两个基因位点的改变：c111T和A253G。A253G位点仅出现在CQ1243和CQ1379,造成了氨基酸Thr85GLA改变。(4) HAdV-3型hexon基因序列形成多个分支,呈现地域差异,但同时存在地域之间的传播。HAdV-3型fiber基因序列4个碱基变异位点：T520C(CQ5685)、A567C、C722A (CQ5)和G742A (CQ483)。其中,A567C位点变异在多株中出现,但未引起氨基酸位点变异；而C722A位点和G742A位点使氨基酸位点发生了改变：Pro261His和Glu278LyS。系统发育树形成三个分支,重庆地区序列均位于A支,遗传距离较近,序列较稳定。(5)本研究成功扩增3株HAdV-55基因组全序,与其他HAdV-55之间同源性在99.8%-99.9%；与HAdV-B2同源性在96.1%-98.7%,以与HAdV-14同源性最高。系统发育分析表现为HAdV-55基因序列具有地域特征。我国地区流行的HAdV-55显示有HAdV-14特征。我国HAdV-55分歧时间大约在1992年,其中CQ814、CQ1657、CQ2903、Hebei/BD/2012随时间依次分化,而Shaanxi/QSDLL/2006分化与CQ1657同时出现。大陆和台湾地区hexon基因分歧时间大约在1997年,我国大陆内分歧时间则更近一些,大约在2005年。我国大陆与新加坡fiber序列分歧时间大约在2004年,与台湾地区分歧时间在2001年左右。3.鼻病毒和肠道病毒(1)在1564份标本中,共检出HRV阳性标本223(14.3%)例,包括HRV-A型120(53.8%)例,HRV-B型11(4.9%)例和HRV-C型92(41.3%)例;同时检出HEV41(2.6%)份,主要包括HEV-687(17.1%)例,HEV-71和CV-A6各5(12.2%)例。(2)重庆地区HRV-C型以HRV-C2为主,其次依次为HRV-C43、HRV-C1和HRV-C17。此外,尚有5条VP4/2基因序列与已知的51个亚型基因序列同源性差异超过10%,本研究暂时命名为HRV-C52, HRV-C53和HRV-C54。分子钟分析发现HRV-C型VP4/2基因序列整体进化速率为6.9×10-3s/s/y (95%HPD:2.5×10-3～12.5×10-3s/s/y)。重庆地区所有HRV-C型基因序列在分子钟树中分为两支,两支的分化时间大约为113年前。从BSP可以看出大约在40年前,人群中有效感染人数出现了大幅度的上升。(3)分子钟分析表明HEV-68VP1基因序列整体进化速率为9.6×1O-3s/s/y (95%HPD:6.9×10-3～12.5×10-3s/s/y)。系统发育树包括三个分支,Lineage3中国分支大约在1973年与其他分支分化,以较高的进化速率进化(3.2×10-2s/s/y,95%HPD:2.1×10-2～4.7×10-2s/s/y),直到2008年进化速率恢复到正常水平。选择压力分析发现VP1基因片段未发现正选择位点,HEV-68主要通过纯化选择方式进化。BSP表明HEV-68有效感染人数在2-4年前出现了短暂的上升,在1998年前保持平稳。空间动力学分析表明日本山形省和美国德克萨斯州是HEV-68迁移的地域源头。(4)首次检测到HEV-118在中国ARTI儿童中存在,其基因序列与HEV-109和HEV-104高度同源。HEV-118中国株VP1基因序列与以色列ISR10株同源性为97%,与秘鲁PERI61株(JX393301)同源性为91%。HEV-118分支进化速率为3.6×10-3s/s/y (95%HPD:1.2×10-3～6.7×10-3s/s/y),与HEV-109分歧时间大约在168年前。4.人博卡病毒(1)重庆地区HBoV全基因组序列同源性为99.4%-100%。其中,HBoV-1各个基因片段序列同源性均高于97%。从同源性分析可以看出HBoV-1基因序列稳定保守。(2) HBoV全基因组序列和各基因片段构建的树基本一致,在HBoV-1分支内并没有出现Bootstrap值>750的分支,推测HBoV-1基因序列不具有时空分布特征。(3) HBoV-1进化速率为1.89×10-4s/s/y(95%HPD：0.01-4.54×10-4s/s/y),低于HBoV整体进化速率。选择压力分析发现VPl基因第40位点为正选择位点,而NP、NS和VP2未发现正选择位(?)结论1.呼吸道病毒流行特征(1)在ARTI儿童中,呼吸道病毒感染率为80.3%,是引起儿童ARTI最主要的病原体。RSV在ARTI儿童中阳性检出率最高,其余依次为PIV、IFV、HRV/HEV和HBoV。重庆地区在2010～2011年期间儿童中可能出现过HAdV暴发。(2)RSV和HAdV感染易引发重症肺炎,而RSV-B、IFV-A和HRV/HEV与哮喘中重度发作有关。2.人腺病毒(1) HAdV在急性呼吸道感染的儿童中存在多个亚型流行,以HAdV-7、HAdV-3和HAdV-55为主;HAdV-7较HAdV-3以及其他亚型更容易引起重症肺炎。(2) HAdV-7和HAdV-3hexon基因和fiber基因序列比较稳定和保守,具有地域特征；其中,HAdV-7hexon基因主要以7d和7d2存在,7d与重症疾病有关。HAdV-55全基因组序列变异较大,具有空间和时间的进化特性。3.鼻病毒和肠道病毒(1) HRV主要以A型和C型为主；而HRV-C又以C2型为主。此外发现并命名三个新亚型：C52～C54。(2)首次在中国急性呼吸道感染儿童中检出HEV-68；系统发育分析发现中国存有多个分支,并且在38年前形成一个新的分支,具有较高的进化速率；HEV-68在世界范围内存在迁移现象。(3)首次获得HEV-118全基因组序列,通过对VP1基因序列分析发现中国株不同于秘鲁株和以色列株。4.人博卡病毒(1) HBoV-1基因序列稳定保守,变异较小(2)选择压力分析发现HBoV-1VP1基因存有正选择位点,表明HBoV-1基因突变不仅存在纯化作用选择,也有正向选择作用影响。