背景：子宫内膜异位症(endometriosis, EMs)是育龄期妇女常见疾病,发病率高,是导致妇女痛经甚至不孕的重要原因之一,且与痛经的严重程度密切相关,严重影响了妇女的生活质量,增加了社会的经济负担,成为当今危害妇女身心健康的一种重要疾病。因其发病机制至今尚未完全阐明,临床治疗面临巨大的困难与挑战,目前治疗中所采用的手术去除病灶和/或抗雌激素等药物治疗虽然有助于改善病情、缓解症状,但最终仍难以避免其再次复发。伤口愈合是一个高度复杂动态的过程,血小板在伤口止血、免疫炎性反应以及组织重塑中起关键作用。由于异位的子宫内膜随月经周期发生周期性出血,周期性的发生血小板活化聚集,故而子宫内膜异位症病灶可能成为一个反复损伤愈合的伤口。本课题研究血小板活化聚集对子宫内膜异位症发生发展的作用,探讨血小板促进内异症发展的机制。第一部分研究血小板及相关分子在内异症病灶的表达情况目的：研究EMs患者病灶中血小板聚集及相关分子的表达情况,探索血小板在参与内异症发展过程中对免疫炎性反应、血管生成及病灶纤维化的作用。方法：取子宫内膜异位症卵巢内膜样囊肿剥除术的67例患者的异位内膜(囊肿囊壁)以及配对37例在位内膜作为病例组,60例腹腔镜下排除内异症或腺肌症的患者子宫内膜作为对照组,免疫组化法检测病灶中血小板及相关分子的表达水平,Masson三色染色法检测病灶纤维化程度,并行血小板及相关分子免疫荧光共定位。结果：免疫组化染色显示EMs患者异位内膜中CD41、CD68、MPO、 HIF1-α、VEGF、CD31-MVD、fibronectin及collagen I表达异常增高(P<0.01),PCNA表达明显；免疫荧光染色显示活化血小板明显聚集于异位病灶的血管周围；内异症发展进程中病灶颜色与纤维化程度呈正相关。结论：内异症病灶中存在血小板活化聚集,血小板可能在参与内异症发展过程中免疫炎性反应、血管生成及病灶纤维化起重要作用。第二部分探索血小板活化对异位ESC的作用,以及异位ESC和内异症腹腔内环境对血小板活化的影响目的：研究血小板活化对异位ESC的作用,以及异位ESC和内异症腹腔内环境对血小板活化的影响。方法：取腹腔镜下确诊并行卵巢内膜样囊肿剥除术的18例患者的腹腔液及20例异位内膜(内膜样囊肿囊壁),作为病例组。取20例腹腔镜下排除内异症或腺肌症患者的腹腔液及12例刮取子宫内膜作为正常对照组。原代培养两组ESC,用活化血小板与异位ESC共培养,采用Western Blot方法比较活化血小板对异位ESC的COX-2、VEGF、MMP-9表达水平的影响,流式细胞术检测活化血小板对异位ESC细胞周期的影响。采用Western Blot法和ELISA法比较两组ESC的TF蛋白水平表达的差异。用不同浓度IL-1p分别处理两组的ESC, WB验证两组细胞COX-2表达上调情况,ELISA法检测两组细胞培养上清中TXB2(TXA2降解产物)及6-keto PGF1α含量的改变。ELISA法比较两组患者腹腔液中TF和人凝血酶含量水平的差异。分别用两组患者腹腔液处理血小板,流式细胞仪检测两组腹腔液对血小板活化程度的不同,并同时检测腹腔液活化血小板的作用是否受到水蛭素的抑制。结果：活化血小板可以明显上调异位ESC的COX-2、VEGF及MMP-9表达水平,并且促进异位ESC分裂增殖(所有P<0.05)。异位ESC的TF表达水平明显高于正常对照(P<0.01)。IL-1β可以明显上调两组ESC的COX-2表达水平,呈剂量依从性,从而使两组ESC细胞培养上清中TXB2的水平增加,呈剂量依从性(P<0.01)。内异症患者腹腔液中TF及人凝血酶含量水平显著高于对照组(P<0.05,P<0.05)。内异症患者腹腔液对血小板的活化作用明显强于对照组(P<0.01),但均可受到水蛭素的抑制。结论：活化血小板对异位ESC具有促炎性反应、促血管生成的作用,并可促进异位ESC侵袭及增殖。内异症病灶及患者腹腔内环境存在有利于血小板聚集的因素,如TF、凝血酶及TXA2都是间接或直接的血小板活化因子,促使血小板在病灶局部活化聚集。可见,血小板与异位病灶及腹腔内环境相互作用,共同促进疾病发展。第三部分体内研究抗血小板治疗或输注／破坏血小板或P-selectin蛋白治疗对模型小鼠痛觉和病灶生长的影响及相关分子机制；探索P-selectin基因敲除对内异症病灶生长的影响目的：研究抗血小板治疗或破坏血小板或P-selectin蛋白治疗对模型小鼠痛觉和病灶生长的影响及相关分子机制；探索P-selectin基因敲除对内异症病灶生长的影响。方法：通过对C57bl-WT小鼠手术建立小鼠内异症模型。建模2周后随机分组,分别给予抗血小板治疗或输注/破坏血小板或可溶性P-selectin蛋白治疗。在建模前、建模2周干预治疗前以及干预治疗2周后,分别热板试验观测小鼠的热板痛阈时间。处死小鼠,取其病灶测量大小,免疫组化染色比较干预治疗组与非干预治疗组小鼠病灶相关分子表达情况；Masson染色比较干预治疗组与非干预治疗组小鼠病灶纤维化程度。并引进P-selectin基因敲除小鼠与C57bl-WT小鼠交叉手术建模,输注或不输WT背景GFP小鼠血小板,研究P-selectin基因敲除以及补偿性输注血小板对模型小鼠病灶生长的影响；冰冻切片观察GFP血小板在病灶局部的聚集情况。结果：各抗血小板聚集的干预治疗组小鼠热痛觉过敏有所改善,病灶缩小(P<0.05), CD41、F4/80、VEGF、CD31-MVD、PCNA、 p-NF-kB、COX-2、collagen I及a-SMA表达降低(P<0.05),纤维化程度减轻；而输注血小板未能再明显增大病灶(P>0.05)。P-selectin基因敲除明显限制小鼠病灶生长及GFP血小板在病灶的聚集。结论：血小板对内异症模型小鼠病灶生长及痛觉过敏起重要作用；P-selectin是介导血小板粘附聚集于病灶,促进病灶生长的关键分子。抗血小板治疗或可溶性P-selectin蛋白治疗能明显改善内异症模型小鼠的痛觉过敏,使病灶缩小,是治疗内异症极有潜力的前景药物。第四部分体内研究在内异症病灶形成发展不同时期破坏血小板或破坏巨噬细胞对模型小鼠腹腔巨噬细胞及病灶生长的影响目的：研究在内异症病灶形成发展不同时期破坏血小板或破坏巨噬细胞对模型小鼠腹腔巨噬细胞及病灶生长的影响。方法：通过对Balb/c小鼠子宫内膜腹腔注射建立小鼠内异症模型。在诱导内异症病灶形成发展的全程输注或破坏血小板或破坏腹腔巨噬细胞；或在诱导内异症病灶形成发展的不同时期破坏血小板或联合破坏腹腔巨噬细胞；并在建模前2天开始干预以及建模12天干预结束后,分别热板试验观测小鼠的热板痛阈时间。处死小鼠,提取腹腔巨噬细胞,流式细胞术检测腹腔巨噬细胞中补偿性活化的(M2型)巨噬细胞比例；取其病灶称重；免疫组化染色比较各干预组与非干预组小鼠病灶相关分子表达情况；HE染色,IPP软件测定病灶间质组织与腺上皮组织面积,计算间质组织与腺上皮组织成分构成比例；Masson染色比较各干预组与非干预组小鼠病灶纤维化程度。结果：在诱导内异症病灶形成发展的全程输注血小板组的模型小鼠病灶明显重于对照抗体组,热痛觉过敏严重(P<0.05),而全程破坏血小板或破坏腹腔巨噬细胞,或在诱导内异症病灶形成发展的不同时期破坏血小板或联合破坏腹腔巨噬细胞均可使病灶生长受到抑制,热痛觉过敏较轻(P<0.05)；全程或早期或晚期破坏外周血血小板或全程破坏腹腔巨噬细胞组均可明显降低模型小鼠腹腔巨噬细胞中补偿性活化的(M2型)巨噬细胞比例；使病灶CD41、F4/80、VEGF、CD31-MVD、 TGF-β1、collagen I和α-SMA表达水平降低(p<0.05)；病灶间质组织与腺上皮组织成分构成比例下降(P<0.05)；纤维化程度减轻。结论：血小板在病灶形成早期内膜粘附种植阶段以及在后期病灶发展纤维化阶段都发挥了重要作用。病灶形成早期破坏外周血血小板可影响子宫内膜的粘附种植生长,并降低模型小鼠腹腔中补偿性活化的(M2型)巨噬细胞的比例,下调TGF-β1,从而对减轻病灶发展后期纤维化起重要作用。