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第一部分NG2蛋白多糖在肾小球中的表达及定位目的：观察大鼠乳鼠肾组织中NG2蛋白多糖的表达及其在肾小球的定位,对三种肾小球固有细胞系进行检测,明确NG2在肾小球三种固有细胞中的具体表达情况。方法：选择出生1天的Wistar大鼠乳鼠,将其肾组织进行固定、包埋后制成石蜡切片,免疫组化检测观察NG2在大鼠乳鼠肾组织的分布,对肾小球中NG2的表达进行定位。以RPMI1640培养基培养条件永生化小鼠足细胞,DMEM培养基培养大鼠系膜细胞,DMEM/F12培养基培养小鼠内皮细胞。间接免疫荧光染色共聚焦显微镜下观察三种肾小球固有细胞中NG2蛋白的表达情况。以RT-PCR法检测足细胞、系膜细胞和内皮细胞中NG2mRNA的表达。结果：NG2蛋白在肾组织中有阳性表达,在肾小球中主要定位于系膜细胞及其周围系膜区。在系膜细胞中NG2蛋白呈阳性表达,NG2均匀分布在系膜细胞胞膜上,而在细胞核上无表达；NG2蛋白在足细胞和内皮细胞中均无阳性表达。RT-PCR从mRNA水平证实了在三种肾小球固有细胞中,NG2仅在系膜细胞中表达。结论：肾小球中NG2表达于间叶组织来源的肾小球系膜细胞,在系膜细胞及其周围的系膜区均有表达,而在另外两种肾小球固有细胞中无表达,提示肾小球中NG2由系膜细胞分泌,并向周围系膜基质中释放。第二部分LPS刺激后大鼠肾小球中NG2蛋白多糖和炎症因子的表达变化目的：观察脂多糖(LPS)刺激后大鼠乳鼠肾小球中NG2蛋白多糖的表达及促炎因子肿瘤坏死因子-a(TNF-aa)和白细胞介素-1p(IL-1β)的表达变化,初步探讨NG2与肾小球炎症反应之间的关系。方法：选择出生1天的Wistar大鼠乳鼠30只,分为3组：对照组、LPS组和LPS+Dex组,分别腹腔注射生理盐水、LPS和LPS+Dexamethasone。12小时后,取其一侧肾组织进行固定、包埋后制成石蜡切片,免疫组化检测NG2在肾小球中的表达变化。另一侧肾组织筛网法分离肾小球,提取肾小球mRNA和蛋白质,实时荧光定量PCR检测NG2、TNF-aa和IL-1βmRNA的表达,ELISA检测肾小球中NG2、TNF-a和IL-1β蛋白的表达。结果：NG2免疫组化结果显示,NG2蛋白在肾小球系膜细胞及周围基质中表达,与对照组相比,LPS刺激后NG2蛋白表达明显增多；LPS刺激并与Dexamethasone干预后NG2蛋白表达较LPS组减少。分离的肾小球提取RNA,实时荧光定量PCR结果显示,LPS刺激后肾小球中NG2、TNF-a和IL-1β mRNA相对表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)；LPS刺激并与Dexamethasone干预后肾小球中NG2、TNF-a和IL-1β mRNA相对表达水平均较LPS组降低,差异有统计学意义(P<0.01)。分离的肾小球提取蛋白,ELISA结果显示,与对照组相比,LPS刺激后RMC中NG2、TNF-a和IL-1p蛋白表达水平均升高,差异有统计学意义(P<0.01)；LPS刺激并与Dexamethasone干预后RMC中NG2、TNF-a和IL-1p蛋白表达水平较LPS组均降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论：肾小球系膜细胞NG2高表达与肾小球炎症密切相关,NG2可诱导促炎因子TNF-a和IL-1p高表达,通过TNF-a和IL-1β介导肾小球炎症反应。介素-1p第三部分NG2蛋白多糖在肾小球炎症与系膜细胞增殖中的作用目的：观察LPS刺激后NG2蛋白多糖和促炎因子TNF-a和IL-1p在大鼠系膜细胞(RMC)的表达变化,以及RMC的增殖情况；NG2-siRNA转染RMC下调NG2表达后,观察促炎因子TNF-a和IL-1p的表达变化及RMC增殖的变化,探讨NG2与肾小球炎症反应及系膜细胞增殖之间的关系。方法：(1)体外培养RMC,将细胞分为3组：对照组、LPS组和LPS+Dex组,干预8小时后,间接免疫荧光染色观察NG2蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测RMC中NG2、TNF-a和IL-1β mRNA的表达,ElISA检测RMC培养上清液中NG2、TNF-a和IL-1p,MTT检测RMC增殖情况。(2)设计及合成NG2-siRNA,用脂质体法将其转入体外培养的RMC,24小时后荧光显微镜下观察转染标志Cy3的表达；48小时后PCR检测NG2的干扰效率。(3)将细胞分为3组：正常对照组、LPS干预组和LPS干预+转染NG2-siRNA组。NG2-siRNA转染及LPS干预8小时后,实时荧光定量PCR检测RMC中NG2、TNF-a和IL-1βmRNA的表达,ElISA检测RMC培养上清液中NG2、TNF-a和IL-1β,MTT检测RMC增殖情况。结果：(1)LPS刺激RMC8小时后免疫荧光结果显示,与对照组相比LPS组中NG2蛋白表达明显增多,且分布均匀。LPS+Dex组NG2蛋白表达较LPS组减少,但仍多于对照组。(2)实时荧光定量PCR和ELISA结果显示,LPS刺激8小时后RMC中NG2、TNF-α、IL-1β mRNA和RMC培养上清液中NG2、TNF-a、IL-1p蛋白表达水平均升高,RMC增殖效率上升,与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.01)。Dexamethasone干预可部分逆转上述反应。(3)NG2-siRNA转染24小时后,Cy3呈强荧光表达；实时荧光定量PCR结果显示,与未转染对照组及阴性siRNA转染组相比,NG2-siRNA转染组NG2表达显著下降,达到下调NG2表达的效果。(4)LPS刺激RMC8小时后,与对照组相比,RMC中NG2、TNF-α、IL-1β mRNA和RMC培养上清液中NG2、TNF-a、IL-1β蛋白表达水平均升高, RMC增殖效率上升,而NG2-siRNA可逆转上述反应,差异有统计学意义(P<0.01)。结论：体外LPS刺激RMC后可NG2表达增加,促炎因子TNF-a和IL-1β的释放增加,RMC增殖效率上升,NG2基因沉默可逆转上述反应。因此,NG2介导促炎因子TNF-a和IL-1β等的释放,且通过肾小球炎症反应的激活促进系膜细胞增殖。