[背景]我国约有70%的人患有不同程度的脱发,其中雄激素性脱发(androgenic alopecia,AGA,又称脂溢性脱发)是最常见的脱发类型之一,患病率很高,男性患病率约为21.3%,女性约为6.0%。该脱发具有遗传因素参与并依赖雄激素作用的特点,表现为常染色体显性遗传。目前绝大多数研究认为,AGA发生的一个重要发病机制为:5α-还原酶的异常升高导致雄激素过度转化为双氢睾酮(DHT),影响毛囊细胞的功能及旁分泌的作用,最终导致脱发。DHT可使毛囊缩小直至消失、毛发生长期缩短、毛发数量/密度减少、终毛减少而毳毛增加。特征性临床表现:在男性主要为头发变细,前额发际线进行性后移,顶部头发进行性减少;在女性主要表现为头发变细,前额发际线维持正常,整个顶部及前额部头发逐渐稀疏。非那雄胺和米诺地尔是AGA治疗中FDA认证的有效的两个药物。但是米诺地尔外用易引起皮炎等,非那雄胺的激素紊乱、性功能障碍等副作用令不少患者担心,非那雄胺在女性患者中的使用也存在争议,且两种药物的效果短暂需要长期使用,以上导致了患者的依从性不佳。因此,更加有效和安全的脱发治疗手段需要被探索。毛囊上皮-间充质细胞之间的交流在毛囊生长和周期调控中扮演着关键的角色。该交流对于细胞分化和胚胎形成及出生后毛囊细胞的生物学活性起着重要的调控作用。毛囊外根鞘细胞来源于毛囊上皮,是毛囊旁分泌中重要的靶细胞之一,不仅调控毛干的生长,且是毛发上皮-间充质信号交流中重要的组成部分,维持毛囊干细胞和发育微环境,参与诱导毛囊形成和生长周期的循环。Wnt/β-catenin信号通路是毛囊生长和周期调控过程中最关键的信号通路之一。该通路在毛囊细胞(如毛母质细胞、外根鞘细胞和毛囊毛乳头细胞)的增殖、迁移和细胞间粘附等功能中起着重要的调控作用。其次,在毛发再生中,Wnt/β-catenin信号通路诱导毛囊生长期发生和维持。第三,Wnt/β-catenin信号促进血管形成并在毛发形态发生中发挥必要的作用。综上所述,Wnt/β-catenin信号对于毛囊调控十分重要,在脱发预防及治疗中扮演着潜在的靶向作用。生物活性分子在细胞生物学、器官形成和组织再生中扮演着重要的作用。内源性的有脂质、蛋白质等,外源性包括一些提取物及合成化合物。生物活性分子对于细胞与细胞外基质的交流和组织内稳态、形态及功能的维持十分重要,且与Wnt信号具有密切联系。本文将对内源性的蛋白多糖decorin和外源性的morroniside进行探索。Decorin是一种小的富含亮氨酸的蛋白多糖家族成员,参与多种生物学过程,如调控胶原的结构和形成、细胞的增殖和迁移及组织的再生等。研究报道decorin在毛囊生物学中起着一定潜在的作用。Decorin在DPC细胞外基质中表达,且调控一些重要的毛囊生长相关的受体,可能参与上皮-间充质之间的交流;我们前期报道decorin在小鼠毛囊生长期高表达而在退行期和休止期相对低表达,且decorin处理组的Wnt信号通路呈高表达现象,提示其在毛囊中扮演着“生长期诱导者”的角色,可能参与毛囊生长周期和形态发生的过程。然而,decorin对毛囊细胞的功能及生长周期调控的作用及是否通过Wnt/β-catenin信号通路介导仍未知。Morroniside是中药山茱萸中富含的环烯醚萜苷类提取物,该提取物在中国被广泛应用。大量研究报道了 morroniside对Wnt信号通路的正反馈调控作用,并参与各种细胞生物学功能和组织再生的调控,如保护细胞减少凋亡,促进细胞增殖、改善血管功能和组织再生。Sun等人研究发现morroniside通过Wnt/β-catenin信号通路介导促进神经干细胞增殖和神经形成。但morroniside在毛囊生长和周期调控中的具体作用如何,是否参与毛囊的Wnt/β-catenin信号通路调控的机制,都尚未查阅到相关研究。因此,本论文中我们将深入探讨decorin和morroniside在毛囊细胞生物学行为和毛囊生长周期调控中的具体作用和机制。第一部分 Decorin对毛囊生长与周期调控的作用及机制研究[目的]探索decorin对体外培养的人毛囊外根鞘细胞的增殖、细胞周期、迁移的影响;明确decorin对人毛囊外根鞘细胞功能影响的相关机制;通过decorin敲除的转基因小鼠模型,阐明decorin在小鼠毛囊生长周期中的作用及其相关机制。并以此为基础进一步发现脱发治疗的新靶点。[方法]分离培养正常人毛囊外根鞘细胞,通过腺病毒转染过表达decorin,以qRT-PCR和Western Blot实验验证细胞过表达decorin;通过MTS实验检测decorin对人毛囊外根鞘细胞增殖的影响;通过Transwell实验检测细胞的迁移能力;通过qRT-PCR和Western Blot法比较decorin过表达组和对照组细胞中Wnt/β-catenin信号通路的基因和蛋白表达;以免疫荧光检测Wnt/β-catenin信号通路中关键分子β-catenin在细胞中表达和定位的改变;用DKK1抑制Wnt/β-catenin信号通路验证decorin对细胞功能的作用可能由该通路介导。构建decorin敲除的转基因小鼠(DCN-/-),通过脱毛诱导新毛囊生长周期的发生,通过hematoxylin-eosin染色对样本进行组织形态学检测,比较皮肤厚度、毛球部直径大小、毛囊生长周期中各阶段毛囊的比例和毛囊生长周期百分数,免疫组化和Western Blot 比较β-catenin在两组的表达和定位改变。[结果]1、Decorin过表达促进人毛囊外根鞘细胞的增殖;2、Decorin过表达促进人毛囊外根鞘细胞的迁移能力;3、Decorin过表达上调人毛囊外根鞘细胞中Wnt/β-catenin信号通路的表达;4、Decorin过表达的人毛囊外根鞘细胞上调的增殖和迁移被DKK1部分下调;5、DCN-/-小鼠的毛囊延迟从休止期进入生长期;6、DCN-/-小鼠的毛囊加速从生长期进入退行期;7、DCN-/-小鼠脱毛诱导的新生毛囊生长周期的静止期-生长期和生长期-退行期两个毛囊周期转换时间点Wnt/β-catenin通路关键信号分子β-catenin下调。[结论]本实验进一步对decorin在毛囊生长和周期调控中的作用和机制进行探索。在体外,decorin促进人毛囊外根鞘细胞的增殖和迁移。在体内实验,decorin维持小鼠毛囊的生长期。上述现象部分通过Wnt/β-catenin信号通路来介导。实验显示decorin在毛囊生长中起着积极作用,在毛囊生长周期中起着“生长期维持者”的角色,对于脱发的治疗研究提供了一定的思路。第二部分 Morroniside在毛囊周期与生长的调控研究[目的]探索morroniside对体外培养的正常人毛囊外根鞘细胞的活性(增殖和迁移)的影响;明确morroniside对体外培养的正常人毛囊外根鞘细胞功能影响的相关机制;阐明morroniside在小鼠毛囊生长周期中的作用及其相关机制。并以此为基础进一步发现脱发治疗的新策略。[方法]分离并获得原代毛囊外根鞘细胞,与morroniside共培养,以MTS实验检测morroniside对离体培养的人毛囊外根鞘细胞增殖的影响;用流式周期检测细胞周期的改变;用mitomycin C预处理细胞后,以Transwell实验检测细胞的迁移能力;以qRT-PCR和Western Blot法比较morroniside和对照组细胞中Wnt/β-catenin信号通路的基因和蛋白表达;以免疫荧光检测Wnt/β-catenin信号通路中关键分子β-catenin在细胞中表达和定位的改变;以TOP/FOP Flash法检测细胞中Wnt通路的激活情况;用DKK1抑制Wnt/β-catenin信号通路验证morroniside对细胞功能的作用可能由该通路介导。脱毛诱导C57BL/6小鼠新生毛囊周期的模型,皮内注射morroniside,通过hematoxylin-eosin染色对样本进行组织形态学检测,比较皮肤厚度、毛球部直径大小、毛囊生长周期中各阶段毛囊的比例和毛囊生长周期百分数,免疫荧光比较morroniside组和对照组Ki67的表达和定位差异,免疫组化和Western Blot 比较β-catenin在两组的表达和定位改变。[结果]1、Morroniside促进人毛囊外根鞘细胞增殖,并上调外根鞘细胞在S期、G2期和S/G1期的比例;2、Morroniside促进人毛囊外根鞘细胞的迁移能力;3、Morroniside激活人毛囊外根鞘细胞Wnt/β-catenin信号通路;4、人毛囊外根鞘细胞经morroniside刺激而上调的增殖和迁移被DKK1部分下调;5、脱毛诱导小鼠毛囊新生周期,局部皮内注射morroniside,加速处理区域毛囊从静止期进入生长期;6、皮内注射morroniside,延缓处理区域毛囊从生长期进入退行期;7、Morroniside处理区域小鼠皮肤与毛囊处在静止期-生长期和生长期-退行期两个毛囊周期转换时间点β-catenin表达上调。[结论]本文实验在国内外首次进行morroniside对毛囊生长和周期调控的作用及机制的探索。在体外实验,morroniside促进人毛囊外根鞘细胞的增殖和迁移。在体内实验,morroniside诱发加速C57BL/6小鼠毛囊生长周期从静止期进入生长期,并推迟退行期发生,总的延长生长期。这些数据显示morroniside在毛囊生长和周期调控中具有积极作用,对脱发的治疗提供了一定的方向和思路。