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研究背景及目的急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是全世界范围内主要的死亡原因之一,及时进行再灌注恢复冠脉血流是挽救尚存活的缺血心肌细胞,进而降低心肌梗死患者死亡率的最有效方法。然而,再灌注本身又可能引发致死性心肌细胞损伤,称为再灌注损伤。再灌注损伤降低了 AMI患者再灌注治疗的收益,探索减轻再灌注损伤的方法具有重要的临床意义。药物后处理是指在组织缺血后再灌注前或再灌注开始的几分钟内给予药物,减轻再灌注损伤的一类心肌保护措施,该操作可控制性强、操作方便,因此在治疗心肌缺血/再灌注损伤方面具有较好的临床应用前景。本工作,针对缺血/再灌注损伤导致心肌细胞死亡过程中自噬流受损这一主要关键科学问题,在查阅文献和前期工作基础上,以改善缺血/再灌注后心肌细胞自噬流为切入点,通过体内和体外实验研究具有心肌保护作用的钙网蛋白后处理的保护作用及其机制。旨在为冠心病缺血心肌保护的机制研究与临床应用提供新的思路。方法:1.制备大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型:结扎大鼠左冠状动脉前降支40min,再灌注24h,复制大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型。于再灌注(解除结扎)前5分钟,经腹腔注射钙网蛋白(0.5mg/kg体重),进行钙网蛋白后处理。2.测定心功能、血清心肌损伤标记物、心肌梗死范围,观察心肌组织形态学改变,证实钙网蛋白后处理减轻心肌缺血/再灌注损伤的作用。3.制备乳大鼠心肌细胞及H9c2心肌细胞H/R损伤模型,于细胞缺氧后、复氧前以25pg/ml钙网蛋白进行后处理。4.CCK-8 法测定细胞活力,以 LIVE/DEAD(?)Viability/Cytotoxicity Kit 测定细胞死亡率,以试剂盒测定乳酸脱氢酶(LDH)、活性氧(ROS)及丙二醛(MDA),确定钙网蛋白后处理减轻乳大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用,及钙网蛋白后处理减轻H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤,同时减轻其氧化应激程度。5.以mRFP-GFP-LC3腺病毒感染心肌细胞,激光共聚焦显微镜下观察细胞内自噬体数目及自噬溶酶体数目,以判断钙网蛋白后处理对缺氧/复氧细胞自噬流的影响。6.Western blot检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3、LAMP-2、p62的表达情况。7.统计学分析:以GraphPad Prism 6.0软件进行统计。采用单因素方差分析确定组间差异,采用LSD法进行组间两两比较,以P<0.05认为差异有统计学意义。结果:1.钙网蛋白后处理可改善缺血/再灌注大鼠心功能,降低血清心肌损伤标记物含量,改善心肌形态结构,减小心肌梗死范围。2.钙网蛋白后处理减轻缺氧/复氧引起的乳大鼠心肌细胞活力下降、LDH漏出;钙网蛋白后处理减轻缺氧/复氧诱导的H9c2细胞死亡、LDH漏出和氧化应激程度。3.钙网蛋白后处理减少缺氧/复氧诱导的H9c2细胞内自噬体聚集,下调缺氧/复氧诱导的H9c2细胞内Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表达、抑制自噬体的过度形成;通过上调缺氧/复氧诱导的H9c2细胞内LAMP-2表达、降低p62水平促进自噬体与溶酶体融合而清除。结论:1.钙网蛋白后处理可减轻在体大鼠心肌缺血/再灌注损伤;2.钙网蛋白后处理可减轻体外培养的心肌细胞缺氧/复氧损伤;3.钙网蛋白后处理可通过抑制自噬体的过度形成,促进自噬体的清除而改善自噬流,发挥减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤的心肌保护作用。