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研究背景慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染损伤宿主免疫应答,致使宿主不能完全清除病毒,肝脏炎症病理持续存在并最终发展为肝硬化和原发性肝癌。在慢性HBV感染中,由于持续暴露于高浓度的HBV抗原之下,HBV特异性的T细胞(HBV-specific T cells)数量减少并且功能耗竭,这是导致HBV感染慢性化的主要原因。目前治疗慢性乙型肝炎(CHB)的长效干扰素α(PegIFNα)可通过激活宿主免疫应答抑制病毒复制,提高HBV e抗原(HBeAg)血清学转换率,并且停药后复发率较低。既往在成人CHB研究中发现PegIFNα能激发HBV特异性T细胞的抗病毒作用,但在儿童CHB中尚未研究。研究目的本研究以PegIFNα治疗HBeAg 阳性儿童CHB为对象,探讨PegIFNα治疗过程中T/NK细胞表型频数及HBV特异性T细胞细胞因子分泌功能的动态变化,并分析其与治疗结局的关系。研究方法1.研究对象以2015-2017年20例PegIFNα治疗HBeAg儿童CHB为对象。收集0,12,24,36,48周肝素钠抗凝外周血,根据治疗结局分为完全应答组(complete response,CR)和不应答病例组(non-response,NR)。CR组定义为HBV DNA,HBsAg和HBeAg三者转阴;NR组定义为HBV DNA,HBsAg和HBeAg三者下降程度均小于 1 log10 IU/mL 或 1 log10 COI。2.HBV病毒定量和血清学检测COBAS TaqMan HBV检测血清病毒定量,雅培i2000检测HBeAg和HBsAg。3.T/NK细胞表型检测Ficoll密度梯度离心法分离得外周血单个核细胞(PBMCs),流式细胞术检测 CR/NR 组 CD69+CD4+/CD8+T 细胞、TRAIL+CD4+/CD8+T 细胞和 TRAIL+CD56+NK细胞的频数。4.HBV特异性细胞应答检测以合成的HBV B基因型的core/envelope/X/CF肽库特异刺激PBMCs 10天,标记CD4+/CD8+T细胞表型后破膜胞内染色IFN-γ并以流式细胞术检测其频数。结果1.PegIFNα 显著降低患儿 HBV DNA、HBsAg、HBeAg 水平HBV DNA、HBsAg、HBeAg和ALT在未治疗患儿中均呈现较高水平(中位数分别为 HBV DNA 1.7E+08 IU/mL,HBsAg 23339.500 IU/mL,HBeAg 1260.690 COI,ALT 110.5 U/L);经过 PegIFNα 治疗后,HBV DNA、HBsAg、HBeAg可见显著下降(中位数分别为HBV DNA 10 IU/mL,HBsAg 0.92 IU/mL,HBeAg 2.17COI,ALT 69 U/L),均有显著差异(P<0.01)。2.CR组CD69+/TRAIL+T细胞频数明显高于NR组经过PegIFNα治疗后,CR组CD69+CD8+T细胞频数显著高于NR组(1.82%vs.0.61%,P=0.0003);同样,TRAIL+CD4+T 和 TRAIL+CD8+T 细胞频数在CR 组也显著高于 NR 组(分别为 1.30%vs.0.19%,P=0.001,1.34%vs.0.34%,P=0.002)。3.CR组T/NK细胞表型随治疗的动态变化选取相邻时间log10 HBV DNA最大变化点(定义为MFC)作为纵向比较的时间点,MFC时间点的CD69+CD4+/CD8+T细胞频数显著高于基线(分别为1.19%vs.0.69%,P=0.01;2.45%vs.1.18%,P=0.003);MFC时间点 TRAIL+CD4+/CD8+T细胞频数同样显著高于基线(分别为2.81%vs.1.92%,P=0.009;2.75%vs.1.89%,P=0.002)。此外,与基线相比,MFC 时间点的 TRAIL+CD56hi NK细胞的频数显著升高(2.00%vs.0.92%,P=0.003)。并且,基线时的TRAIL+CD56hi NK细胞频数与基线的ALT水平呈正相关(r=0.663,P=0.002)。4.CR组HBV T细胞特异性应答水平显著高于NR组HBV特异性T细胞应答在CR组和NR组可检测到阳性结果。在基线时间点,CR组的core/envelope肽库特异性刺激的IFN-γ+CD4+/CD8+T细胞频数显著高于NR组(均值0.68%vs.0.26%,P=0.001);而在治疗结束时,两组HBV特异性T细胞应答水平的差异进一步增大。在CR组中,治疗结束时间点的core特异性的IFN-γ+CD4+/CD8+T细胞应答水平显著高于基线(0.67 vs.1.04,P=0.009;0.5 vs.0.91;P=0.041);基线core/envelope特异性的IFN-γ+CD4+/CD8+T频数分别与log 10 HBV DNA从基线到12 周的下降程度呈正相关(r=0.639,P=0.002;r=0.680,P=0.001)。结论在PegIFNα治疗儿童CHB中,早期增强的HBV特异性T细胞应答水平与治疗结局相关,强效的HBV特异性T细胞应答预示更易发生HBsAg转阴,最终可达到临床治愈。