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心脏异常电触发活动诱发的致命性心律失常是导致心衰患者发生心源性猝死(Sudden cardiac death, SCD)的主要原因。CaMKII在心衰时的高表达状态及其相关的钙调控机制异常与心脏触发活动的发生密切相关。在心衰等交感兴奋的疾病状态下,钙/钙调素依赖蛋白激酶II(CaMKII)对ICa-L和细胞内钙稳态等电触发活动相关机制起主要调控作用。急性抑制CaMKII活性可以有效改善心衰细胞钙活动,减少心脏触发活动。但是,CaMKII活性长期抑制后,可能会因为相关蛋白表达和功能水平变化而造成不同结果。基于上述研究和理论,我们选用CaMKIIδ基因敲除小鼠为研究对象,分别研究了正常状态和心衰状态下,长期维持心脏CaMKII的低活性状态对心肌细胞电触发活动的影响,并对相关机制进行了探讨。第一部分钙/钙调素依赖蛋白激酶Ⅱδ基因敲除对心脏触发活动的影响之一——正常心肌细胞的研究目的:研究长期降低CaMKII活性后对正常心肌细胞电触发活动的变化及其相关机制。方法:以CaMKIIδ基因敲除(KO)小鼠为研究对象。分离单个心肌细胞后,用CaMKII活性试剂盒鉴定心肌细胞CaMKII活性变化。用心肌细胞牵张偶联模型评价心肌细胞早期后除极(EAD)诱发情况。用膜片钳技术记录心肌细胞ICa-L、INCX的变化。用钙通道阻断剂Nifedipine和含Ba2+灌流液,评价钙电流和钠钙交换体电流增加在EAD发生中的作用。以Fura-2为细胞Ca2+指示剂,用细胞钙成像系统检测心肌细胞钙瞬变和肌浆网钙泄漏水平。Western blot分析CaMKII、钙通道蛋白Cav1.2和NCX蛋白的表达情况。结果:生理状态下CaMKII活性降低后,CaMKIIδ-KO和正常WT心肌细胞EAD诱发率分别为94%(30/32)和13%(4/30,p<0.05),诱发KO心肌细胞EAD所需的牵张水平(Gsac)显著低于WT心肌细胞(3.4±0.4 ns vs.7.6±0.9 ns, p<0.05).KO心肌细胞的钙电流(-7.2±0.3 pA/pF vs.-6.2±0.2 pA/pF, p<0.05)和钠钙交换体电流强度(-0.52±0.11 pA/pF vs.-0.30±0.06 pA/pF, p<0.05)显著高于WT心肌细胞;其相应的蛋白表达水平也显著高。进一步用钙通道阻断剂Nifedipine可以完全抑制KO心肌细胞EAD的发生。用含Ba2+外液灌流,对KO心肌细胞的EAD诱发情况并不造成影响。心肌细胞钙成像结果显示,KO和WT心肌细胞的舒张期钙浓度和钙瞬变幅度无明显差异;而KO心肌细胞的肌浆网钙泄漏水平显著较WT心肌细胞降低(p<0.05)。结论:(1)适当的CaMKII生理活性水平对维持心肌细胞电活动的平衡起到重要作用。(2)长期过度降低CaMKII活性会引起正常心肌细胞L型钙通道、NCX蛋白上调以及相应电流强度增加,从而导致细胞电不稳定性增加。第二部分钙/钙调素依赖蛋白激酶Ⅱδ基因敲除对心脏触发活动的影响之二——心衰心肌细胞的研究目的:观察长期维持CaMKII低活性状态下,心衰心肌细胞电触发活动的变化及其相关机制方法:用主动脉缩窄方法制作KO和WT小鼠心衰模型,4周后用心超评价心功能状态,选取EF值<50%的心衰小鼠作为研究对象。分离单个心肌细胞后,用CaMKII活性试剂盒鉴定心肌细胞CaMKII活性变化。采用心肌细胞牵张偶联模型比较CaMKIIδ-KO小鼠和对照组WT小鼠发生心衰后心肌细胞的EAD诱发情况。用膜片钳技术记录心肌细胞ICa-L、INCX。并用细胞钙成像系统检测心肌细胞钙瞬变和肌浆网钙泄漏水平。Western blot分析CaMKII、钙通道蛋白Cav1.2和NCX蛋白的表达情况。结果:心衰状态下,KO心衰(KO-HF)心肌细胞的CaMKII活性降低显著低于对照组心衰(WT-HF)心肌细胞。KO-HF心肌细胞EAD诱发率(50%,7/14)显著低于WT-HF心肌细胞分别为(84.2%,16/19; p<0.05). KO-HF心肌细胞诱发EAD所需的牵张水平(Gsac)较WT-HF心肌细胞显著提高(15.7±2.1 ns vs. 7.2±0.5ns, p<0.05)。KO-HF心肌细胞的ICa-L的电流峰值较WT-HF心肌细胞显著降低(-5.3±0.3 pA/pF和-7.0±0.3 pA/pF, p<0.05);而钙通道蛋白Cav1.2的表达无变化。KO-HF心肌细胞INCX的内向电流强度较WT-HF心肌细胞显著降低(-0.37±0.06 pA/pF vs.-0.65±0.14 pA/pF, p<0.05),且相应的NCX蛋白表达水平也低于WT-HF细胞。心肌细胞钙成像结果显示,KO-HF和WT-HF心肌细胞的舒张期钙浓度和钙瞬变幅度无明显差异;而KO-HF心肌细胞的肌浆网钙泄漏水平显著低于WT-HF心肌细胞(p<0.05)。结论:(1)在CaMKII表达增高的心衰状态下,长期维持心脏CaMKII低活性状态可以有效减少心衰心肌细胞的异常电触发活动的发生。(2)在心衰状态下,长期维持心脏CaMKII的低活性水平可以减少心衰心肌细胞ICa-L和INCX电流强度,降低NCX蛋白表达水平,减少肌浆网钙泄漏,有利于增加心衰心肌细胞的电稳定性。