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目的:建立一种快速、准确、特异的RV荧光定量RT-PCR检测方法,用于RV的检测。研究方法:从GenBank数据库下载所有已登录的A组RV不同病毒株的VP6基因全长序列,经MegAlign软件分析,选取VP6羧基端长约220bp的保守区段作为扩增靶序列。并以此为模板,按照实时荧光定量PCR寡核苷酸设计原则,设计合成上、下游引物和TaqMan探针。在TaqMan探针的5’端标记荧光物FAM,在距离5’端14bp处标记荧光淬灭物TAMRA。以本实验室保存的pcDNA3.1-VP6为模板,进行PCR扩增,扩增产物用于构建重组质粒pcDNAⅡ-220。荧光定量PCR采用外标准曲线绝对定量的方法,以自行构建的包含靶序列的重组质粒pcDNAⅡ-220为标准品,梯度系列稀释后,用于建立纵轴为阈循环数（Ct值）,横轴为模板起始拷贝数对数值（LogCO）的外标准曲线。通过实时监测各样本PCR过程中荧光信号的累积,根据其Ct值,对不同样本中病毒拷贝数进行定量。并进一步对初步建立的荧光定量PCR体系进行退火温度、镁离子浓度、聚合酶浓度以及模板准备等条件的优化,尽可能缩短反应时间。对不同滴度的细胞培养SA-11标准株,分别使用自行建立的荧光定量PCR方法和商售ELISA双抗体夹心法平行检测,对荧光定量PCR体系的检测范围、灵敏度、特异性以及可重复性等参数进行评价。于2004年秋冬季共收集小儿腹泻粪便样本113份,常规处理后,分别使用荧光定量PCR方法和ELISA双抗体夹心法平行检测,对检测结果进行统计学分析。 结果:该荧光定量RT-PCR体系的检测范围为1～10,000 TCID50/ml,最低检测水平为1 TCID（50）/ml,商售轮状病毒ELISA试剂盒最低检测水平为10 TCID50/ml。标准曲线线性良好,阈循环数与样品中病毒起始拷贝数间相关系数r=0.998。对113份临床腹泻粪便样本的检测结果显示,荧光定量RT-PCR检测阳性80例（70%）,商售ELISA试剂盒检测阳性76例（67%）,两者均为阳性67例,仅实时荧光定量PCR检测阳性13例。统计学分析认为,该荧光定量RT-PCR体系与ELISA的检出率无明显统计学差别,（X2=0.41,P>0.5）。