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目的:增生性瘢痕是病理性瘢痕的一种,是皮肤真皮损伤愈合后瘢痕部位持续增生的一种病理现象,表现为高出正常皮肤、发红、坚硬,有时伴有瘙痒、疼痛等不适症状,不仅影响容貌和功能,还会给患者造成心理负担,而增生性瘢痕的防治是现代医学的难题之一,因此,寻找治疗和预防瘢痕增生的有效药物具有重要的意义。本课题选用著名皮肤病学专家赵炳南的经验方——黑布药膏,采用破瘀软坚之法来治疗兔耳增生性瘢痕,研究黑布药膏对兔耳增生性瘢痕动物模型成纤维细胞组织形态学、细胞增殖与凋亡及胶原合成与降解等方面的影响,从细胞、分子水平探讨黑布药膏治疗和预防增生性瘢痕的机制,为黑布药膏外用治疗增生性瘢痕提供理论和实验依据。材料与方法:成年大耳白兔24只,随机分成3组,即正常对照组、瘢痕模型组和黑布药膏治疗组。正常对照组不施加任何处理因素,瘢痕模型组和黑布药膏治疗组进行增生性瘢痕造模,建立兔耳增生性瘢痕动物模型,21d后,造模成功,在黑布药膏治疗组瘢痕局部涂抹黑布药膏,每3d 1次,连续用药56d。在用药第2,4,6,8周分别切取两组瘢痕组织,进行指标检测。肉眼观察,在瘢痕形成和治疗过程中皮肤及瘢痕变化情况;HE染色,光镜下观察增生性瘢痕组织病理形态学改变,计算瘢痕增生指数和成纤维细胞密度;VG染色,光镜下观察增生性瘢痕组织胶原的变化,计算胶原面密度;采用免疫组化方法进行PCNA的检测,光镜下观察成纤维细胞的增殖情况,并计算PCNA阳性表达率;采用TUNNEL法进行细胞凋亡的原位检测,光镜下观察成纤维细胞的凋亡情况,并计算凋亡率;实时定量PCR(RT-PCR)法检测Bax、Bcl-2 mRNA的表达;RT-PCR法检测I、Ⅲ型胶原和基质金属蛋白酶-1 mRNA的表达;蛋白免疫印迹法(Western-blot)法检测转化生长因子-β1蛋白的表达。结果:1.肉眼观察,在兔耳腹侧面形成创面后,在造模后12～14d时,伤口基本愈合,并能触到硬结,造模后20～22d时,硬结更加明显,高于皮面,呈淡红色,增生范围不超过原创沿,厚度约为兔耳腹面皮肤厚度的2倍。模型组在上皮化后第六周瘢痕增生达到最高峰,厚度约为兔耳腹面皮肤厚度的3倍。黑布药膏治疗组随着给药时间的延长,瘢痕逐渐软化,体积逐渐缩小,趋于平复,色变淡。2.光镜下观察,模型组可见真皮组织明显增生、变厚,由大量成纤维细胞、胶原组织及血管组成,胶原排列不整齐,呈结节或旋涡状分布,随时间推移,无明显变化。黑布药膏治疗组随时间推移瘢痕组织内血管、成纤维细胞逐渐减少,胶原纤维逐渐减少,呈淡红色,稀疏,排列较整齐。3.黑布药膏对兔耳增生性瘢痕瘢痕增生指数的影响黑布药膏治疗组较模型组瘢痕增生指数降低,从上皮化第4周开始,治疗组与模型组有显著性差异(P<0.01),并随着时间推移,瘢痕增生指数降低愈加明显。4.黑布药膏对兔耳增生性瘢痕成纤维细胞密度的影响模型组成纤维细胞密度明显高于正常组,与正常组比较有显著性差异(P<0.01),在上皮化后4周达到最高值,之后逐渐降低。黑布药膏可降低成纤维细胞密度,与模型组比较有显著性差异(P<0.05)。5.黑布药膏对兔耳增生性瘢痕胶原面密度的影响模型组胶原纤维的面密度明显高于正常组,与正常组比较有显著性差异(P<0.01),在上皮化后6周达到最高值,之后逐渐降低。黑布药膏可降低胶原纤维的面密度,从上皮化后第四周开始与模型组比较有显著性差异(P<0.01)。6.黑布药膏对兔耳增生性瘢痕PCNA的影响免疫组化法进行PCNA检测显示:正常皮肤表皮基底细胞层PCNA阳性表达,真皮层阳性表达较少。模型组除基底细胞PCNA阳性表达及部分棘细胞层和颗粒细胞层呈阳性表达外,真皮层见大量PCNA阳性表达细胞,与正常皮肤相比差异有显著性(P<0.01),治疗组PCNA阳性细胞较模型组明显减少,相比有显著性差异(P<0.05)。7.黑布药膏对兔耳增生性瘢痕细胞凋亡的影响TUNNEL法进行细胞凋亡原位检测,结果显示:在成纤维细胞和血管内皮中可见凋亡小体,即凋亡细胞。正常组皮肤中只有少量阳性细胞,瘢痕模型组上皮化2周到4周,凋亡率与正常皮肤相比无明显差异,上皮化后6周开始凋亡率降低,随时间推移凋亡率降低愈加明显,但和正常组相比没有统计学意义(P>0.05)。黑布药膏治疗组凋亡细胞较前模型组增多,真皮中见较多凋亡的成纤维细胞,而到了上皮化6周时达到凋亡高峰,至上皮化8周时凋亡率仍然持续很高。黑布药膏治疗组与模型组瘢痕凋亡率有显著性差异(P <0.01)。8.黑布药膏对兔耳增生性瘢痕Bax mRNA表达的影响实时定量PCR法检测Bax mRNA的表达,结果显示:与正常组比较,模型组Bax mRNA表达降低(P<0.05),并且随着上皮化时间越长,降低愈明显,从上皮化第六周开始,与正常组相比差异更加显著(P<0.01)。治疗组BaxmRNA表达较模型组明显增加,相比有显著性差异(P<0.01),并且随着上皮化时间越长,增加愈明显。9.黑布药膏对兔耳增生性瘢痕Bcl-2mRNA表达的影响实时定量PCR法检测Bcl-2mRNA的表达,结果显示:与正常组比较,模型组Bcl-2 mRNA表达增加(P<0.01),并且随着上皮化时间越长,增加愈明显。治疗组Bcl-2mRNA表达较模型组明显降低,从上皮化后4周开始相比有显著性差异(P<0.01),并且随着上皮化时间越长,降低愈明显。10.黑布药膏对兔耳增生性瘢痕I型胶原mRNA表达的影响实时定量PCR法检测I型胶原mRNA表达,结果显示:与正常组比较,模型组I型胶原mRNA表达显著升高(P<0.01),并且随着上皮化时间越长,升高愈明显。治疗组I型胶原表达较模型组降低,从上皮化后4周开始有显著性差异(P<0.01),并且随着上皮化时间越长,降低愈明显。11.黑布药膏对兔耳增生性瘢痕Ⅲ型胶原mRAN表达的影响实时定量PCR法检测Ⅲ型胶原mRAN表达,结果显示:模型组Ⅲ型胶原mRNA表达较正常组降低,并且随着上皮化时间越长,降低愈明显,从上皮化后6周开始,与正常组比较有显著性差异(P<0.01)。黑布药膏治疗组Ⅲ型胶原mRNA表达较模型组升高,并有显著性差异(P<0.01),并且随着上皮化时间越长,升高愈明显。12.黑布药膏对兔耳增生性瘢痕基质金属蛋白酶-1mRNA表达的影响实时定量PCR法检测基质金属蛋白酶-1mRNA的表达,结果显示:模型组MMP-1 mRNA表达较正常组降低,两组比较有显著性差异(P<0.01),并且随着上皮化时间越长,降低愈明显。治疗组基质金属蛋白酶-1mRNA表达较模型组明显增加,相比有显著性差异(P<0.01),并且随着上皮化时间越长,增加愈明显。13.黑布药膏对兔耳增生性瘢痕转化生长因子-β1蛋白表达的影响Western-blot法检测转化生长因子-β1mRNA的表达,结果显示:与正常组比较,模型组转化生长因子-β1表达显著升高(P<0.01),并且随着上皮化时间越长,升高愈明显。治疗组转化生长因子-β1表达较模型组降低,从上皮化后4周开始有显著性差异(P<0.05),从上皮化后6周开始,差异更加显著(P<0.01),并且随着上皮化时间越长,降低愈明显。结论:1.黑布药膏能够明显抑制成纤维细胞增殖及降低胶原纤维的含量,显著降低增生性瘢痕瘢痕增生指数、成纤维细胞密度及胶原面密度,从而抑制增生性瘢痕组织增生。2.黑布药膏能够显著降低兔耳增生性瘢痕PCNA阳性表达率,增加细胞凋亡率,降低Bax mRNA表达,增加Bcl-2 mRNA表达,抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖,诱导细胞凋亡。3.黑布药膏能够显著降低兔耳增生性瘢痕Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达,显著增加Ⅲ型胶原蛋白和基质金属蛋白酶-1mRNA的表达,降低转化生长因子-β1蛋白的表达,从而降低瘢痕组织胶原含量,增加胶原酶含量。