研究背景：急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)是一种严重危害人类生命健康的临床综合征,肝移植是目前最有效的治疗肝衰竭的方法,但是,肝移植由于供体短缺及费用昂贵等问题限制了其广泛应用。因此,迫切需要探索新的治疗方法以挽救肝衰竭患者的生命。近年来许多动物及临床研究发现,骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)可以在体内外诱导分化为肝细胞,BMSC移植可以在体内增殖、分化为肝细胞或肝样细胞,替代受损的肝细胞,促进肝功能恢复,因此,有人已将BMSC移植用于治疗ALF并显示出具有显著的疗效。目前,对于BMSC治疗肝衰竭作用机制的研究主要集中在BMSC的分化潜能方面。然而实验研究发现,BMSC在体外诱导分化为肝细胞需要6-12天,体内分化也需要4-5天,而BMSC在移植的早期未分化为肝细胞或肝样细胞时即显示出具有显著的疗效,用干细胞分化机制不足以解释BMSC移植的这种早期应答。那么,BMSC移植早期是通过何种机制发挥作用?有研究提出,BMSC具有抗炎和免疫调节作用,这种作用是否在BMSC移植早期发挥其效应?另外,大量临床研究结果表明,ALF患者伴有的肠源性内毒素血症(Intestinal Endotoxemia, IETM)在肝衰竭的发生发展过程中起重要作用,内毒素可以直接损伤肝细胞,还可以激活下游炎症级联反应,引起大量肝细胞凋亡及坏死,导致肝衰竭。韩德五教授提出了IETM是各种原因导致肝衰竭发生的唯一的共同物质基础,并且这一理论在实验和临床研究中已经得以证实。那么：BMSC对ALF大鼠IETM究竟有何作用?其作用机制如何?是本文的研究重点。本课题首先建立一种简便、快捷的体外分离培养大鼠BMSC的方法,在此基础上观察BMSC移植治疗ALF大鼠的作用,从细胞水平及在体水平探讨其可能的机制,为临床治疗ALF提供新的思路。本研究共分三个部分：第一部分骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学特性的研究第二部分骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠肠源性内毒素血症的影响第三部分骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠肠源性内毒素血症治疗作用机制的研究第一部分骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学特性的研究目的建立一种简便、快速、有效的体外分离培养大鼠BMSC的方法并进行初步鉴定。方法无菌条件下取大鼠四肢长骨骨髓,在含20%胎牛血清的DMEM/F12中贴壁培养,倒置显微镜下观察细胞的形态变化；采用免疫细胞化学方法检测细胞膜抗原CD34、CD44及CD45的表达；采用流式细胞术检测细胞周期；细胞加成脂诱导剂体外培养14天后,行油红O染色,观察细胞分化结果。结果分离培养的细胞2-3天后呈多形性贴壁生长并开始大量增殖,3代以后的细胞呈均一的成纤维细胞样形态。免疫细胞化学染色显示,细胞表面分子CD44阳性,CD34、CD45阴性。细胞周期检测结果显示,(80.13±1.24)%的第3代BMSC处于G1期。细胞加成脂诱导剂后14天经油红O染色可见胞质内有橙红色的脂滴。结论采用全骨髓贴壁培养法可以方便、快捷地获得BMSC,并且在体外培养条件下能大量增殖,经诱导后可以向脂肪细胞分化,具有干细胞的生物学特性,是一种比较理想的体外培养方法。第二部分骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠肠源性内毒素血症的影响实验一急性肝衰竭大鼠伴肠源性内毒素血症模型的建立目的探讨用不同剂量硫代乙酰胺(Thioacetamide, TAA)制作ALF大鼠伴IETM模型的量-效关系。方法设立3个TAA剂量组,每组10只,分别以200、400、600 mg/(kg·d)剂量的TAA灌胃,24h后相同剂量TAA重复灌胃一次,建立不同剂量TAA致大鼠IETM的动物模型,并设立对照组,以等体积0.9%氯化钠溶液灌胃。观察造模后24h、48h大鼠的死亡率,48h后剩余大鼠腹主动脉采血检测血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)及血浆内毒素含量,取部分肝脏及回肠组织作常规HE染色,光镜下观察肝脏及回肠组织的病理变化。结果不同剂量TAA组大鼠在肝损伤评分、ALT、AST、内毒素水平方面与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。TAA剂量越大,死亡率越高,肝损评分、ALT、AST及内毒素水平也越高。200mg/kg TAA模型组肝坏死不明显,400mg/kg TAA模型组与600mg/kg TAA模型组有明显肝坏死,ALT、AST及内毒素水平与200mg/kg TAA组相比明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。不同剂量TAA模型组有不同程度的肠粘膜损伤。结论TAA致肝损伤具有明显的剂量依赖性,其中400 mg/(kg·d)TAA剂量为制备ALF伴IETM模型的适宜剂量。实验二骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠内毒素及细胞因子的影响目的探讨BMSC移植对TAA所致ALF大鼠内毒素及TNF-α、IL-10的影响。方法雌性Wistar大鼠30只,体重250±10g,随机分为对照组、TAA模型组和TAA+BMSC治疗组,每组10只。采用TAA 400mg/kg灌胃,24h后重复灌胃建立ALF大鼠模型,对照组给予0.9%氯化钠溶液2m1灌胃；第二次灌胃后将BMSC(1×106个细胞/只)经尾静脉移植到TAA+BMSC治疗组大鼠体内,对照组和TAA模型组大鼠经尾静脉给予等量无菌磷酸盐缓冲液(PBS)。BMSC治疗72h后将大鼠麻醉状态下腹主动脉采血,检测血清中ALT、AST以及血浆内毒素含量,ELISA法检测血浆及肝组织匀浆中TNF-α、IL-10含量。取部分肝组织及回肠组织作常规病理检查。结果TAA模型组与对照组比较,大鼠血清ALT、AST、血浆内毒素、血浆与肝组织TNF-α、IL-10水平均显著上升(P<0.05), TNF-α/IL-10的比值明显升高。TAA+BMSC治疗组与TAA模型组相比大鼠血清ALT、AST以及血浆内毒素水平均显著降低,血浆与肝组织IL-10水平明显升高,TNF-α/IL-10的比值明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。TAA+BMSC治疗组与对照组相比,血浆与肝组织TNF-α/IL-10的比值无明显差异(P>0.05)。病理切片显示BMSC能够明显减轻TAA对肝组织的损害,TAA模型组及TAA+BMSC治疗组回肠组织病理显示均有不同程度损害。结论TAA造模形成的ALF大鼠伴有IETM, BMSC尾静脉移植对ALF大鼠IETM有一定的保护作用,可以调节促炎与抗炎因子达到新的平衡,这可能是BMSC移植治疗ALF的作用机制之一。第三部分骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠肠源性内毒素血症治疗作用机制的研究实验一骨髓间充质干细胞对脂多糖刺激枯否细胞分泌细胞因子的影响目的探讨在体外条件下BMSC对脂多糖(LPS)刺激后大鼠肝脏枯否细胞(KC)分泌TNF-α的影响。方法采用全骨髓贴壁培养法分离、纯化大鼠BMSC,原位灌流、Percoll密度梯度离心法原代分离培养肝KC,取体外培养48h后的KC用于实验,用LPS(终浓度1μg/ml)刺激KC,BMSC加入KC中建立BMSC共培养体系,实验分为四组：①KC组；②KC+LPS组；③KC+LPS+BMSC组；④KC+LPS+BMSC培养上清组。LPS作用24h、48h、72h后收集培养上清检测培养体系中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。结果无LPS刺激时,正常肝脏KC培养上清中可检测到少量TNF-α,经LPS刺激后KC培养上清中TNF-α含量明显上升；而与BMSC共培养时,TNF-α含量显著减少(P<0.05)；KC与BMSC培养上清共培养时,TNF-α含量与②组相比明显减少,与③组相比TNF-α含量较高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论BMSC可以抑制LPS刺激后大鼠肝脏KC的活化,减少TNF-α的分泌,BMSC培养上清同样可以抑制KC的活化,但作用比BMSC弱。实验二骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠CD14、NF-κB的影响目的观察BMSC移植对ALF大鼠肝组织中内毒素受体CD14及核因子NF-κB表达的影响。方法30只雌性Wistar大鼠,体重250±10g,随机分为对照组、TAA模型组和TAA+BMSC治疗组,每组10只,BMSC移植治疗72h后将各组存活大鼠麻醉,腹主动脉采血后取部分肝组织备检。SABC免疫组化法检测肝组织中内毒素受体CD14及核因子NF-κB的表达。结果对照组肝组织可见少量CD14、NF-κB表达阳性的细胞。TAA模型组与对照组相比,CD14、NF-κB表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。经BMSC治疗后,CD14、NF-κB表达比TAA模型组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),与对照组相比,BMSC治疗组CD14、NF-κB仍然很高,差异也有统计学意义(P<0.05)。结论BMSC移植可以抑制肝组织CD14及NF-κB的表达。BMSC移植可能通过抑制内毒素受体CD14及核因子NF-κB的表达来阻断内毒素在体内发挥效应。