家蚕(Bombyx mori Linaeus)是我国的重要经济昆虫,与此同时,家蚕又是一种重要的昆虫致敏原。家蚕蚕蛹在传统中医中作为一种药物被用来治疗高血压和脂肪肝,中国人有食蚕蛹的习惯,有关食用蚕蛹引发过敏的病例也时有报道,因此在中国,蚕蛹是一种重要的食物过敏原。本文旨在对家蚕蚕蛹的过敏原进行研究。1.家蚕蚕蛹过敏原的SDS-PAGE和免疫印迹分析:首先利用超速离心法提取家蚕蚕蛹的总蛋白,用12%的SDS-PAGE对蛋白粗提液进行分离,之后分别用11份家蚕蚕蛹过敏病人的血清与蛋白进行IgE结合测试。结果发现:家蚕蚕蛹的蛋白有10多条蛋白质条带,其中在25kDa附近3条为主带。在与11份患者血清的反应中,共检测到分子量近似为28、35、37、65、90kDa的阳性蛋白条带。其中28、35、37、65kDa处的蛋白条带与血清的阳性反应率达到了100%。提示家蚕蚕蛹中确实存在着特定的过敏原蛋白。2.家蚕蚕蛹过敏原的蛋白质组学研究:本部分实验目的是通过双向电泳、免疫印迹、质谱的方法对家蚕蚕蛹过敏原有更明确的研究。首先用双向电泳对家蚕蚕蛹蛋白进行分离,构建较为完整的家蚕蚕蛹蛋白双向电泳图谱;接着利用免疫印迹方法,使电转印到膜上的蛋白与阳性家蚕蚕蛹过敏患者混合血清进行反应,对于能够与过敏病人血清中IgE结合的蛋白进行质谱鉴定。实验结果显示:家蚕蚕蛹蛋白在双向电泳中被成功分离,共得到288个蛋白点。在免疫印迹实验中,共有13个蛋白点可以与家蚕蚕蛹过敏病人血清发生阳性反应,而在阴性对照中,未见其发生阳性反应;对这13个阳性点进行质谱鉴定后,发现它们分别属于6类不同的蛋白:卵黄原蛋白、30K家族蛋白、几丁质酶、丙糖磷酸盐异构酶、热休克蛋白20.8和家蚕血液胰凝乳蛋白酶抑制剂。3.家蚕蚕蛹过敏原蛋白几丁质酶原核表达载体的构建。本部分实验目的在于构建家蚕蚕蛹几丁质酶原核表达载体。提取家蚕蚕蛹RNA并反转录得到cDNA,利用设计好的PCR引物通过RT-PCR得到几丁质酶的基因片段,并将其与载体pET-28a连接,构建表达载体。结果显示:通过RT-PCR得到的几丁质酶的基因片段的核酸序列与数据库中的序列吻合,成功构建家蚕蚕蛹几丁质酶原核表达载体。为家蚕蚕蛹过敏原几丁质酶的重组表达和免疫活性鉴定奠定了基础。4.家蚕蚕蛹过敏原蛋白热休克蛋白20.8的克隆、表达、纯化与免疫学活性鉴定:通过分子生物学的方法得到的重组过敏原蛋白,可以被应用于过敏诊断和免疫治疗。本部分实验目的在于得到具有免疫学活性的热休克蛋白20.8重组蛋白。提取家蚕蚕蛹RNA并反转录得到cDNA,利用设计好的PCR引物通过RT-PCR得到热休克蛋白的基因片段,并将其与载体pET-28a连接,构建表达载体。进一步通过IPTG诱导得到热休克蛋白的重组蛋白,用Ni2+亲和层析柱进行分离,将得到的蛋白与家蚕蚕蛹过敏病人血清反应,以检测其免疫学活性。结果显示:通过RT-PCR得到的热休克蛋白的基因片段的核酸序列与数据库中的序列吻合;通过构建表达载体和IPTG诱导得到了重组的热休克蛋白20.8,且其具有免疫学活性。通过本系列研究鉴定了家蚕蚕蛹总蛋白中的致敏组分,建立了其蛋白质组学双向电泳图谱及双向电泳免疫印迹图谱,成功地建立其过敏原几丁质酶原核表达载体,并对过敏原热休克蛋白20.8进行了克隆、表达、纯化和免疫学鉴定,为家蚕蚕蛹的蛋白质组学、分子生物学的基础研究奠定了坚实的基础,同时为家蚕蚕蛹过敏性疾病的特异性诊断及治疗提供了理论依据。