论文部分内容阅读
非小细胞肺癌(non-small celllung cancer,NSCLC)是肺癌中最常见的病理类型,其治疗包括手术、放疗、化疗、分子靶向治疗以及这些治疗的不同联合治疗。晚期NSCLC患者治疗主要有化疗和靶向药物,而化疗往往达不到理想疗效,分子靶向药物治疗因以其针对性强、副作用少的特点,应用越来越广泛。吉非替尼(Gefitinib)是表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factorreceptoe-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKIs),一线治疗 EGFR 突变的晚期 NSC LC。据临床研究报道,未经选择的化疗失败或复发的晚期NSCLC患者应用EGFR-TKIs,其疗效与二线化疗相当。提示对于EGFR分型未知晚期NSCLC患者,一线化疗失败后也可以试用EGFR-TKIs。如何提高EGFR-TKIs对这类患者的疗效,让这些患者从EGFR-TKIs治疗中获益,延长治疗间期,具有临床治疗意义。自噬(Autophagy)作为细胞应对压力的存活机制,对细胞存活具有双重作用:一是保护细胞存活,另一个是促进细胞凋亡。线粒体自噬(Mitophagy)属于自噬的特殊类型之一,是指通过自噬选择性清除损伤线粒体。研究表明,肺癌细胞存在自噬缺陷或自噬过度均可影响EGFR-TKIs疗效。小白菊内酯(Parthenolide)是倍半萜烯内酯的主要成分,从中草药野生甘菊中提取,原用于治疗发热、偏头痛、关节炎等疾病。近年来研究发现,小白菊内酯在多种肿瘤中具有较强的抗癌作用,诱导肿瘤细胞发生自噬,而且可以增强化疗和放疗对肿瘤细胞的杀伤性。目前为止,有关小白菊内酯联合吉非替尼治疗肺癌鲜有报道。本研究在体外实验将小白菊内酯联合吉非替尼作用于A549细胞,观察对A549细胞增殖、凋亡、线粒体损伤、诱导自噬及线粒体自噬的影响,探讨自噬在诱导凋亡中的作用。而在体内实验中,建立人肺癌A549细胞裸鼠移植瘤模型,观察小白菊内酯联合吉非替尼对裸鼠移植瘤的生长抑制作用、凋亡相关蛋白、自噬相关蛋白及STAT3活性,并探讨其抑制肿瘤生长的机制。通过本研究为化疗失败的EGFR分型未知晚期NSCLC患者应用靶向药物和中草药提取物的联合治疗方案提出理论依据。第一部分线粒体自噬在小白菊内酯增强吉非替尼诱导肺癌A549细胞的凋亡中的作用目的:探讨线粒体自噬在小白菊内酯增强吉非替尼对A549细胞诱导凋亡中的作用。方法:首先MTT法检测不同浓度小白菊内酯和吉非替尼作用下对A549细胞的存活率,计算半数抑制浓度(harf-inhibitory concentration,IC50);再将A549细胞分为对照组(C组,等容培养液)、吉非替尼组(G组,吉非替尼1Oμmol/L)、小白菊内酯组(P组,小白菊内酯5μmol/L)、小白菊内酯联合吉非替尼组(PG组,小白菊内酯5μmol/L+吉非替尼1Oμmol/L)。利用MTT法检测细胞存活率;划痕修复实验观察细胞增殖能力;TUNEL法染色荧光镜下观察凋亡细胞;Anne xinV-FITC/PI染色后利用流式细胞仪检测细胞凋亡率;JC-1荧光探针标记法检测线粒体膜电位的变化;DCFH-DA荧光探针标记后流式细胞仪检测细胞内活性氧水平;透射电镜下观察细胞内自噬体的超微结构;利用Western Blotting法检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9及自噬相关蛋白LC3-II/I、Beclin-1、PINK1表达;联合用药组加入自噬抑制剂3-MA后,利用流式细胞仪检测细胞凋亡率,利用 Western Blotting 法检测 Beclin-1、caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达。结果:1.小白菊内酯和吉非替尼对A549细胞的IC50值分别为(35.77±2.05)μmol/L和(15.38±1.13)μmol/L。取5μmol/L小白菊内酯和10μmol/L吉非替尼作用于A549细胞,G组、P组细胞存活率均低于C组,而PG组细胞存活率分别显著低于P组和G组,各组间比较均有统计学差异(均P<0.05)。2.在用药前Oh时各组细胞划痕距离相同,划痕上无迁移细胞;与Oh比较,用药48h后C组、G组、P组划痕距离均明显缩小、划痕上见迁移细胞,而PG组划痕距离则无明显差异。PG组划痕修复率分别显著低于C组、G组、P组,均有统计学差异(均 P<0.05)。3.在荧光镜下观察,凋亡细胞体积缩小,连接消失,与周围的细胞脱离,细胞质密度增加,胞膜结构仍然完整。在相同视野下,G组、P组凋亡细胞均多于C组,PG组凋亡细胞分别显著多于G组、P组,.其差异均有统计学意义(均P<0.05)。4.与C组比较,G组、P组细胞凋亡率升高,而PG组细胞凋亡率分别显著高于G组、P组,.其差异均有统计学意义(均P<0.05)。5.与C组比较,G组Bcl-2/Bax比值、caspase-3和caspase-9蛋白表达量无明显差异(均P>0.05)。P组Bcl-2/Bax比值低于C组,PG组分别显著低于P组、G组,其差异均有统计学意义(均P<0.05)。P组caspase-3和caspase-9蛋白表达量均高于C组,PG组分别显著高于P组、G组,其差异均有统计学意义(均P<0.05)。6.JC-1探针标记后观察,C组显示明显红色荧光、未见绿色荧光;G组见轻微减弱的红色荧光和微弱绿色荧光线;P组可见明显减弱的红色荧光和较强的绿色荧光线;PG组可见进一步减弱的红色荧光和显著增强的绿色荧光。比较红色/绿色荧光比例,G组与C组无明显差异(P>0.05),P组低于C组,PG组均显著低于G组、P组,各组间比较均有统计学差异(均P<0.05)。7.DCF探针标记后,测定C组、G组、P组、PG组活性氧水平分别为0.94±0.15、1.53±0.06、2.03±0.12、3.14±0.16。G 组与 C 组无明显差异(P>0.05),P 组高于C组,PG组分别显著高于G组、P组,各组间比较均有统计学差异(均P<0.05)。8.TEM超微结构观察,C组细胞器结构完整,基本没有自噬体的形成;G组细胞内未见自噬体的形成;P组有少量自噬体出现;PG组可见出现大量的自噬体。9.与C组相比,G组LC3-II/I比值、Beclin-1、PINKI蛋白表达量均无明显差异(均P>0.05),P组表达量均升高,而PG组表达量分别显著高于G组和P组,各组间比较均有统计学差异(均P<0.05)。10.3-MA组细胞凋亡率与C组相比无明显差异(P>0.05),加入3-MA前PG组细胞凋亡率为(16.52±1.48)%,加入3-MA后PG组细胞凋亡率降至(9.64±0.73)%,具有统计学差异(P<0.05)。与PG组比较,3-MA+PG组Beclin-1和caspase-3蛋白表达量均显著下降,Bcl-2/Bax比值显著升高,其差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:1.小白菊内酯作为天然自噬诱导剂增强吉非替尼对肺癌A549细胞的抗增殖和诱导凋亡作用;2.小白菊内酯可能通过线粒体凋亡途径增强吉非替尼诱导肺癌A549细胞的凋亡;3.小白菊内酯联合吉非替尼可能通过激活自噬促进肺癌细胞凋亡;4.线粒体自噬可能参与小白菊内酯增强吉非替尼诱导肺癌A549细胞的凋亡作用。第二部分小白菊内酯联合吉非替尼对A549细胞移植痼生长作用及机制研究目的:探讨小白菊内酯联合吉非替尼对裸鼠移植瘤生长的作用及其机制。方法:将人肺癌细胞A549制成细胞悬液后接种于裸鼠皮下,建立人肺癌A549细胞裸鼠皮下移植瘤模型,模型成功10天后将裸鼠将随机分为对照组(C组)、吉非替尼组(G组)、小白菊内酯组(P组)、小白菊内酯+吉非替尼组(PG组),分别给予等容生理盐水、吉非替尼25mg/kg/d、小白菊内酯25mg/kg/d、小白菊内酯25mg/kg/d+吉非替尼25mg/kg/d,灌胃及腹腔注射给药,每周给3次药物,每2天测量瘤体体积,3周后处死裸鼠,剥取肿瘤组织,测定最终瘤体大小及计算肿瘤抑制率;HE染色法观察移植瘤组织及细胞间隙形态学变化;应用Western Blot法检测肿瘤组织内凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3和自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-II 以及p-STAT3、STAT3 蛋白表达。结果:1.药物干预移植瘤约3周后,测定C组、G组、P组和PG组移植瘤体积分别为(732.21±36.34)mmm3、(627.01±76.04)mm3、(459.63±29.76)mm3 和(311.27±33.67)mm3。G组与C组移植瘤体积无明显差异(P>0.05);P组移植瘤体积小于C组,PG组移植瘤体积均显著小于G组和P组,各组间均有统计学差异(均P<0.05)。2.C组、G组、P组和PG组抑瘤率分别为0%、14.36%、37.22%、57.48%。G组与C组抑瘤率无明显差异(P>0.05);P组抑瘤率显著高于C组,PG组抑瘤率显著高于G组和P组,各组间均有统计学差异(均P<0.05)。3.HE染色后观察,C组移植瘤细胞增生活跃、紧密连接,G组移植瘤细胞间隙略疏松,P组细胞间隙疏松、可见小片坏死区域,PG组移植瘤细胞间隙明显疏松、可见大片坏死区域。4.与C组比较,G组、P组的caspase-3蛋白表达均升高,PG组的caspase-3蛋白表达高于G组、P组,各组间均有统计学差异(均P<0.05)。G组、P组的Bcl-2/Bax比值均低于C组,PG组的Bcl-2/Bax比值分别显著低于G组、P组,各组间均有统计学差异(均P<0.05)。5.G组与C组相比,Beclin-1、LC3-II蛋白表达量均无差异(均P>0.05)。P组与C组比较,Beclin-1、LC3-II蛋白表达量均升高(均P<0.05),PG组Beclin-1、LC3-II蛋白表达量均显著高于P组和G组,各组间均有统计学差异(均P<0.05)。与C组比较,G组、P组和PG组的p-STAT3蛋白表达量减少,PG组p-STAT3蛋白表达量显著均低于G组、P组,各组间均有统计学差异(均P<0.05)。结论:1.吉非替尼对裸鼠移植瘤的生长无明显抑制作用;2.小白菊内酯增强吉非替尼对A549细胞移植瘤的生长抑制作用,可能与诱导移植瘤细胞凋亡、抑制STAT3活性、激活自噬相关。