【摘 要】
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目的:探究心肌细胞内不同水平的ROS与细胞死亡的关系,以及PGAM5在ROS诱导的不同细胞死亡中的作用及机制。方法:利用不同浓度的t-BHP干预H9c2不同时间,CCK8和流式细胞术检测细胞死亡率和细胞内ROS水平,建立H9c2细胞死亡模型。Seahorse X9细胞能量代谢仪检测H9c2细胞呼吸耗氧率、细胞外呼吸酸化率、实时ATP生成速率和检测线粒体呼吸功能相关指标。采用Annexin V-FI
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目的:探究心肌细胞内不同水平的ROS与细胞死亡的关系,以及PGAM5在ROS诱导的不同细胞死亡中的作用及机制。方法:利用不同浓度的t-BHP干预H9c2不同时间,CCK8和流式细胞术检测细胞死亡率和细胞内ROS水平,建立H9c2细胞死亡模型。Seahorse X9细胞能量代谢仪检测H9c2细胞呼吸耗氧率、细胞外呼吸酸化率、实时ATP生成速率和检测线粒体呼吸功能相关指标。采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡水平;Western-Blot方法检测cleaved-caspase 3、caspase 1、cleaved-caspase 1、cleaved-GSDMD、RIP1、RIP3、Keap1、PGAM5的表达;Elisa方法检测MLKL、p-MLKL、GPX4、Fe2+、AIFM1和p-AIFM1的表达;q RT-PCR法检测PGAM5m RNA的表达;免疫荧光法检测PGAM5的定位。构建PGAM5 si RNA干扰质粒,转染H9c2细胞,并在H9c2细胞中验证PGAM5 m RNA和蛋白质的表达变化。抑制PGAM5表达后,利用Western-Blot和Elisa方法观察了对细胞死亡标志物以及p-Drp1-S637和p-Drp1-S616表达的影响,并采用JC-1方法检测了细胞线粒体膜电位水平的变化。采用单因素方差分析的方法进行各组间比较。结果:（1）t-BHP干预浓度为0、50、75、100、125、150μmol/L和干预时间为2h可诱导细胞内ROS呈梯度性升高和细胞存活率梯度性降低,成功构建细胞死亡模型。（2）t-BHP干预诱导细胞线粒体氧化磷酸化耗氧率和糖酵解耗氧率呈下降趋势,线粒体呼吸功能各项指标显著降低;（0-125）μmol/L t-BHP干预后,细胞通过线粒体氧化磷酸化生成ATP的实时速率的比例显著升高,通过糖酵解生成ATP的比例显著降低,150μmol/L t-BHP干预后,通过线粒体氧化磷酸化和糖酵解生成ATP的速率无明显变化。（3）t-BHP从50μmol/L开始诱导细胞凋亡率逐渐升高,从100μmol/L开始诱导cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 1、cleaved-GSDMD、Fe2+、LC3 II/I表达升高,p-MLKL、GPX4表达降低;t-BHP从125μmol/L开始诱导Keap1、PGAM5表达升高,p-AIFM1表达降低。（4）t-BHP＜100μmol/L时,PGAM5 m RNA和总PGAM5的表达显著降低,t-BHP≥100μmol/L时,PGAM5 m RNA、总PGAM5和剪切型PGAM5的表达显著升高。t-BHP诱导细胞内ROS水平的升高导致PGAM5从线粒体向细胞质易位,线粒体向核周聚集。（5）抑制H9c2细胞中PGAM5的表达,显著逆转了100μmol/L t-BHP干预组中cleaved-caspase 3、cleaved-GSDMD、RIP1、RIP3、Fe2+、LC3 II/I的表达升高,和p-MLKL的表达降低。以及150μmol/L t-BHP干预组中Keap1的表达降低,和p-AIFM1的表达升高。（6）t-BHP≥100μmol/L时,可诱导H9c2细胞中p-Drp1-S637的表达逐渐升高。抑制PGAM5的表达后,导致p-Drp1-S616的表达显著降低,MMP的水平显著升高。结论:（1）t-BHP干预可诱导H9c2细胞内ROS水平升高。H9c2细胞内低水平的ROS即可诱导细胞凋亡的发生,中等水平的ROS开始诱导细胞焦亡、自噬、铁死亡和坏死性凋亡,而诱导氧死亡需要高水平的ROS。（2）随着细胞内ROS水平的升高,PGAM5逐渐从线粒体向细胞质易位,PGAM5 m RNA和总PGAM5蛋白的表达呈先降低再升高的趋势,中等水平的ROS可以诱导剪切型PGAM5蛋白表达升高。（3）PGAM5参与调控细胞内ROS诱导的细胞凋亡、焦亡、铁死亡、自噬和坏死性凋亡和氧死亡。（4）PGAM5通过影响Drp1-S616的磷酸化介导线粒体裂变,进而导致细胞死亡。
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