论文部分内容阅读
目的:急性肝衰竭是一种罕见但却威胁生命的疾病,通常为既往无肝病史的病人伴随着急速的大量肝细胞失去功能。慢加急性肝衰竭与急性失代偿性肝衰竭不同,在慢性肝功能不全的基础上发生,伴随失代偿期诸多并发症,并且与较高的脏器衰竭率有关。它们均会伴随许多严重的神经系统并发症,包括脑水肿及肝性脑病,以及以严重认知和精神损伤为特征的,从意识变化至昏迷的精神系统疾病。数十年来,氨在急性肝衰竭神经系统并发症的病理生理基础中具有至关重要作用。但是在近期的研究中,无论是在人或者是在动物模型中都强烈的提示我们,炎症反应,也作为单独或者与氨共同作用的因子参与其中。炎症反应是急性肝衰竭的一个重要的特征,促炎细胞因子水平的升高更是独立于潜在肝病病因学之外的危险因素。在这些促炎细胞因子中肿瘤坏死因子TNF-α发挥强效作用,它通过激发多种炎症反应并且可以触发下游靶点如白介素-6的合成来实现免疫功能。在肝性脑病的氨中毒学说中,NH3具有干扰三羧酸循环使脑细胞能量供应不足、增加抑制脑功能的中性氨基酸的吸收、使星形胶质细胞及神经元细胞肿胀致脑水肿、干扰神经的电活动等毒性作用都能促进和加剧HE的发生。氨转运蛋白家族Rh糖蛋白为NH3和NH4+的跨膜转运提供便利与途径。其中,RhCG存在非红细胞中,同时表达于各种不同的组织,包括肝脏、肾脏、胃肠道、皮肤等,且被认为可以对氨进行转运。本文章旨在研究RhCG与TNF-α之间的作用机制。研究方法:HBMEC复苏、传5代,以2×105 cells/孔铺2个6孔板,培养2天。分别于不同时间点加入人TNF-α(0.1μg/mL ECM),放入37℃,5%CO2孵箱中继续培养,同时收集细胞运用PCR及Western Blot检测RhCG RNA及蛋白。并统计RhCG RNA及蛋白随着不同作用时间的TNF-α的变化而变化的趋势。根据不同时间点加PKC抑制剂处理,分组:(1)TNF-α处理0小时组;(2)TNF-α处理24小时组;(3)Safingol单独处理组;(4)TNF-α+抑制剂组:预先处理HBMEC细胞1小时后,再予TNF-α刺激24小时。应用Western blot方法检测HBMEC细胞中RhCG蛋白的表达水平。并统计RhCG蛋白不同组别的变化趋势。研究成果:成功复苏、培养HBMEC,并获得稳定传代。分别于不同时间点加入人TNF-α并收集细胞后,运用Western Blot检测到RhCG蛋白随着TNF-α作用时间的延长表达增加,24小时表达量最高。运用PCR检测到RhCG RNA随着TNF-α作用时间的延长表达增加,24小时表达量最高。在证明肿瘤坏死因子TNF-α可以增加HBMEC细胞中RhCG mRNA及蛋白的表达的基础上,加入PKC-α特异性抑制剂Safingol,RhCG蛋白的表达随之下降,差异有统计学意义。结论:肿瘤坏死因子TNF-α可以上调HBMEC细胞中RhCG mRNA及蛋白的表达。PKC-α参与TNF-α上调HBMEC细胞中RhCG的表达的作用。