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杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）为国家二级保护植物,用途广泛。杜仲药用成分主要包括苯丙素类、木脂素类、黄酮类和多糖类等,可用于治疗高血压、糖尿病、类风湿性关节炎等疾病。糖基转移酶是一类负责催化小分子化合物糖基化反应的酶,通过将活性糖基从核苷糖转移到激素、次级代谢物、病原菌侵染物以及植物内外源毒性物质等一系列植物小分子化合物受体上,从而影响着植物体的各种代谢活动。近年来大量学者对植物中部分糖基转移酶相关基因进行了克隆并对其功能进行了鉴定分析,糖基转移酶在植物中主要影响化合物糖苷化作用、类黄酮物质、木质素的合成以及参与植物抗逆反应等多种生物学途径。为进一步丰富植物中糖基转移酶家族成员以及更好地了解不同植物中糖基转移酶的生物学功能,本研究克隆了杜仲糖基转移酶编码基因EuGT3,对其进行了生物信息学分析,以及对其在杜仲组织器官中的表达特征进行分析,并构建了植物过表达载体p CAMBIA1300-35S-EuGT3,通过农杆菌花序浸染法遗传转化拟南芥,成功获得转基因拟南芥植株。用获得的转基因拟南芥来验证分析EuGT3基因的功能。取得如下结果:1 EuGT3基因的克隆及生物信息学分析通过RACE（cDNA末端快速扩增技术）技术从杜仲中成功克隆得到一个编码糖基转移酶蛋白的基因,通过拼接得到全长为1441bp的CDS序列,共编码481个氨基酸。对该基因编码的蛋白结构域进行分析,发现该序列中含有保守序列PSPG盒结构,确定为糖基转移酶家族,将其命名为EuGT3。进一步对EuGT3进行生物信息学分析,结果表明,EuGT3分子量为64 KDa,理论等电点为p I:4.97,不含信号肽不具有跨膜结构,属于疏水性蛋白,具有多个糖基化位点。2 EuGT3基因亚细胞定位及组织表达量分析构建融合表达载体p CAMBIA1300-35S-EuGT3-GFP,采用烟草作为实验材料,通过烟草叶片的瞬时表达实验对EuGT3进行亚细胞定位。结果显示EuGT3-GFP融合蛋白在细胞膜中表达。利用q RT-PCR方法检测EuGT3基因在杜仲幼苗不同部位的表达量,结果分析表明,EuGT3在根、茎和叶中均有表达,但在根、茎和叶中的表达量无显著差异。因此该基因在杜仲根、茎和叶中的表达无组织特异性。3 EuGT3基因植物表达载体的构建及遗传转化拟南芥以pCAMBIA1300-35S-GUS为基础载体,构建以目的基因EuGT3、35S为启动子、GUS为报告基因、抗性筛选为卡娜霉素（Kan）和潮霉素（Hyg）的植物表达载体p CAMBIA1300-35S-EuGT3。利用农杆菌转化体系,将p CAMBIA1300-35S-EuGT3质粒采用农杆菌花序侵染法遗传转化拟南芥。从转化第一代种子（T1）开始进行抗性植株的筛选,直到无性状分离现象结束,结合GUS组织化学染色和PCR检测,对通过抗性筛选的转基因植株进行鉴定,共获得21株抗性纯合的转基因拟南芥植株。q RT-PCR结果表明在21个转基因拟南芥株系中,TP-2、TP-9、TP-12和TP-21四个株系的EuGT3基因表达量较高,以这四个株系的T3代进行后续实验。4过表达EuGT3基因对拟南芥植株表型的影响选取相同培养条件下的转EuGT3基因、野生型和转空载体拟南芥植株观察表型差异,对比不同时期转EuGT3基因植株、野生型和转空载体植株表型后发现,两者在生长发育过程中表型有所差异。在拟南芥植株整个生长过程中,转基因拟南芥的生长进程快于同龄野生型和转空载体拟南芥植株,尤其转EuGT3基因拟南芥植株抽薹开花较野生型和转空载体早。以移栽至营养土21d后的转EuGT3基因、野生型和转空载体拟南芥植株进行叶片数及莲径大小统计,以拟南芥植株从下往上数第6叶片测量叶片长度和叶片宽度;以移栽至营养土35d后的转EuGT3基因和野生型拟南芥植株进行株高和分枝数统计。结果发现,转基因拟南芥平均叶片长度4.21±0.32 cm,叶片宽度1.49±0.42 cm,叶片数量19.41±0.48,莲径8.52±0.41 cm,株高25.23±0.43 cm,分枝数9.31±0.24;野生型拟南芥平均叶长4.04±0.12cm,叶宽1.43±0.37 cm,叶数16.02±0.35,莲径8.21±0.52 cm,株高21.92±0.26cm,分枝数6.05±0.30;转空载体拟南芥平均叶片长度3.97±0.28 cm,叶片宽度1.44±0.12 cm,叶片数量16.35±0.02,莲径8.34±0.09 cm,株高21.35±0.18 cm,分枝数6.18±0.23。与野生型拟南芥相比转EuGT3基因拟南芥在叶数、株高和分枝数方面有显著差异,而在叶长、叶宽和莲径方面差异未达显著水平。推测在转EuGT3基因的拟南芥中,糖基转移酶EuGT3可能参与了植物激素例如细胞分裂素、生长素的调控,从而影响了拟南芥植株的出叶片数、株高及分枝数。5过表达EuGT3基因拟南芥植株类黄酮含量检测及种子萌发率实验对过表达EuGT3基因和野生型拟南芥植株进行类黄酮物质含量测定。结果发现EuGT3-2、EuGT3-9、EuGT3-12和EuGT3-21四个株系的类黄酮含量均高于野生型,分别为野生型拟南芥类黄酮含量的2.25、2、2.4和2.53倍,均达到极显著水平。说明EuGT3参与了拟南芥的类黄酮代谢,过表达可以使拟南芥中类黄酮类含量明显增加。将过表达EuGT3基因纯合体拟南芥、转空载体和野生型植株的新收T3代种子接种在相同培养基上萌发。结果发现,转EuGT3基因、空载体和野生型植株的T3代种子在正常培养基上的萌发率并无差异,萌发率均能达到100%。随后以不同浓度Na Cl和甘露醇对拟南芥种子进行盐胁迫和干旱胁迫处理,观察胁迫下种子的萌发率。结果发现,在胁迫处理下转EuGT3基因、空载体和野生型拟南芥的种子萌发率存在差异,即转基因拟南芥的萌发率比野生型和转空载体的高,且随着胁迫浓度的增加,这种现象更为明显。推测在胁迫环境下糖基转移酶EuGT3可能参与了植物体内激素的调控、抗逆活性成分的合成,从而提高了植物抵抗胁迫环境能力。