论文部分内容阅读
目的： 1.获取NaKuI3的全长cDNA序列，并进行生物信息学分析 2.构建pET32a-sumo/NaKuI3原核表达载体 3.在大肠埃希菌中表达NaKuI3，并分离、纯化重组蛋白 4.检测rNaKuI3对丝氨酸蛋白酶的抑制活性 方法： 1.获取NaKuI3的全长cDNA序列，并进行生物信息学分析 根据美洲钩虫GenBank序列（GenBank No. XM_013451492.1）设计引物，以美洲钩虫cDNA为模板，通过SMART-RACE分离出NaKuI3的5和3末端序列。用DNAstar对获得的5和3末端完整序列进行比对拼接，获得全长cDNA序列。利用生物信息学软件分析预测NaKuI3的信号肽、理化性质、二级结构，并在Genbank数据库中搜索相似氨基酸序列。 2. NaKuI3的原核表达系统的构建 PCR扩增NaKuI3的成熟肽编码序列，纯化与预期大小相符的扩增产物，用限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切后回收酶切产物，用T4 DNA连接酶22℃连接2h，连接产物转化至E. coli DH5α感受态细胞，重组质粒用PCR、酶切进行鉴定，并送上海生工公司测序，鉴定正确的重组质粒命名为pET32a-sumo/NaKuI3。 3. rNaKuI3的蛋白表达与纯化 重组表达质粒pET32a-sumo/NaKuI3转化到E.coli BL21(DE3)中。用IPTG诱导表达目的蛋白rNaKuI3，SDS-PAGE电泳分析表达情况。Ni-NTA亲和层析柱纯化重组融合蛋白，SUMO蛋白酶柱上酶切去除融合伴侣，得到目的蛋白rNaKuI3。 4. rNaKuI3的抑制活性检测 采用发色底物法检测rNaKuI3对人中性粒细胞弹性蛋白酶、猪胰蛋白酶、纤溶酶、人中性粒细胞组织蛋白酶G、人蛋白酶3等的活性抑制作用。