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目的: 1.获取NaKuI3的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析 2.构建pET32a-sumo/NaKuI3原核表达载体 3.在大肠埃希菌中表达NaKuI3,并分离、纯化重组蛋白 4.检测rNaKuI3对丝氨酸蛋白酶的抑制活性 方法: 1.获取NaKuI3的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析 根据美洲钩虫GenBank序列(GenBank No. XM_013451492.1)设计引物,以美洲钩虫cDNA为模板,通过SMART-RACE分离出NaKuI3的5和3末端序列。用DNAstar对获得的5和3末端完整序列进行比对拼接,获得全长cDNA序列。利用生物信息学软件分析预测NaKuI3的信号肽、理化性质、二级结构,并在Genbank数据库中搜索相似氨基酸序列。 2. NaKuI3的原核表达系统的构建 PCR扩增NaKuI3的成熟肽编码序列,纯化与预期大小相符的扩增产物,用限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切后回收酶切产物,用T4 DNA连接酶22℃连接2h,连接产物转化至E. coli DH5α感受态细胞,重组质粒用PCR、酶切进行鉴定,并送上海生工公司测序,鉴定正确的重组质粒命名为pET32a-sumo/NaKuI3。 3. rNaKuI3的蛋白表达与纯化 重组表达质粒pET32a-sumo/NaKuI3转化到E.coli BL21(DE3)中。用IPTG诱导表达目的蛋白rNaKuI3,SDS-PAGE电泳分析表达情况。Ni-NTA亲和层析柱纯化重组融合蛋白,SUMO蛋白酶柱上酶切去除融合伴侣,得到目的蛋白rNaKuI3。 4. rNaKuI3的抑制活性检测 采用发色底物法检测rNaKuI3对人中性粒细胞弹性蛋白酶、猪胰蛋白酶、纤溶酶、人中性粒细胞组织蛋白酶G、人蛋白酶3等的活性抑制作用。