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本研究从五指山小型猪外周血淋巴细胞中分离DNA,对五指山小型猪内源性反转录病毒(PERV-WZS)进行检测,确认猪内源性反转录病毒在五指山小型猪基因组中存在并且表达。在此基础上对PERV-WZS基因组的五个基因分别克隆后相互拼接得到PERV-WZS全基因序列。
从五指山小型猪外周血淋巴细胞中分离DNA,运用PCR方法对猪内源性反转录病毒(PERV-WZS)进行分型检测。然后从五指山小型猪外周血淋巴细胞中分离RNA,在此基础上根据对GenBank已登录的3株猪内源性反转录病毒(PERV)全基因组序列同源性分析,选择基因组中5’长末端重复序列(5’-LTR)、核心蛋白基因(gag)、酶蛋白基因(pol)、囊膜蛋白基因(env)和3’长末端重复序列(3’-LTR)这五个相互吡邻的基因中各个基因首、尾相对保守的区域设计了15条引物,应用RT-PCR、套式PCR和RACE方法扩增了覆盖五指山小型猪PERV-WZS株全基因组的5个首尾重叠的cDNA片段,将这些片段克隆到pGEM-Tvector上进行测序,每个片段至少要对两株克隆测序,得到了组成PERV基因组的五个基因的克隆。将这五个基因依次拼接得到了PERV-WZS株的全基因组序列,并对其进行系统分析。
PERV-WZS株属于PERV-A亚型逆转录病毒,由8637bp的核苷酸组成,其中A占27.3%、T占22.77%、G占25.56%、C占24.36%。它包括5’长末端重复序列(5’-LTR)、gag基因、pol基因、env基因和3’长末端重复序列(3’-LTR)。其中非编码区5’-LTR由1050个核苷酸组成,比已知的5’端长约500bp,3’-LTR由546个核苷酸组成;编码区由gag基因、pol基因、env基因组成;包含三个开放阅读框(ORF1,nt1036-2608;ORF2,nt2597-5869;ORF3,nt6069-8038),其中ORF1编码核蛋白、ORF2编码酶蛋白、ORF3编码囊膜蛋白。进化树分析表明,在基因水平PERV-WZS与AJl33817(PERV-A亚型)毒株的亲缘关系最近,与AF038600(PERV-C亚型)、AF038601(PERV-B亚型)及其它PERV毒株的亲缘关系较远。同源性分析表明,PERV-WZS株与AJ133817毒株(PERV-A亚型)、AF038600毒株(PERV-C亚型)和AF038601毒株(PERV-B亚型)的核苷酸同源性分别为90.7%、21.9%和24.9%。PERV-WZS株与PERV-A亚型病毒AJ133817同源性最高。
本研究得到了五指山小型猪内源性反转录病毒的全基因序列,在此基础上对其分子生物学特性及遗传衍化关系进行分析。