目的人乳头瘤病毒(HPV)是一种双链环状小DNA病毒,与宫颈癌密切相关,95%的宫颈癌的病例中均能检测到人乳头瘤病毒。大量的流行病学调查资料显示,高危型HPV也与口腔癌的发生密切相关,目前关于HPV与口腔癌关系的研究主要集中于对高危型HPV E6和E7基因的研究,而忽略对致癌基因E5的研究。E5基因存在于高危型HPV全基因组,而引起口腔良性肿瘤的低危型HPV基因组一般都缺乏E5基因,或者虽有E5基因但缺乏翻译E5的起始密码子;同时研究表明E5基因在肿瘤形成的早期及增强E6和E7基因对细胞的恶性转化中起重要作用。本实验分别构建高危型HPV E5、E6和E7 3个癌基因的重组慢病毒载体,成功转染人口腔上皮细胞,并对E5基因对口腔上皮细胞相关作用进行了初步分析,为阐明高危型HPV E5基因与口腔癌的相关性奠定基础。方法(1)PCR扩增16型人乳头瘤病毒(HPV16)E5、E6和E7基因,利用Bam H I和Eco R I双酶切位点构建p LVX-Ac GFP-E5、p LVX-Ac GFP-E6和p LVX-Ac GFP-E7 3种慢病毒核心质粒,经酶切验证及测序后,分别将正确的重组质粒与包装质粒通过脂质体法共转染293T细胞,48小时后收集3种慢病毒颗粒上清,浓缩后用逐步稀释法测定病毒滴度,并分别感染口腔上皮细胞,嘌呤霉素筛选得到稳定转染的细胞株,RT-PCR和Western blot检测目的基因的表达。(2)将稳定转染致癌基因的口腔上皮细胞株分为A、B、C、D组,其中A组稳定感染p LVX-Ac GFP-E5、p LVX-Ac GFP-E6和p LVX-Ac GFP-E7慢病毒,B组稳定感染p LVX-Ac GFP-E6和p LVX-Ac GFP-E7慢病毒,C组稳定感染p LVX-Ac GFP-E5慢病毒,D组稳定感染p LVX-Ac GFP-N1(空载体)慢病毒,未感染的口腔上皮细胞作为空白对照组(E组)。通过比较组与组之间的细胞黏附率、细胞增殖能力以及E6、E7基因m RNA水平的表达量,初步分析E5基因对口腔上皮细胞的致癌机制。结果(1)成功获取E5、E6和E7基因,双酶切验证和DNA测序结果表明,重组慢病毒载体插入序列完全正确。(2)获得3种慢病毒上清,逐步稀释法检测慢病毒载体p LVX-Ac GFP-E5、p LVX-Ac GFP-E6和p LVX-Ac GFP-E7病毒滴度分别为3×108 TU/ml、2×108 TU/ml和2×108 TU/ml。(3)筛选得到3个稳定转染的细胞株,RT-PCR和Western blot均可检测到HPV16 E5、E6和E7基因在口腔上皮细胞内表达,即3种慢病毒颗粒成功在靶细胞内表达。(4)通过对各组细胞间的黏附率和细胞增殖能力比较及分析发现,单独的E5基因不能促进口腔上皮细胞增殖和粘附(P>0.05),E5基因协同E6和E7基因共转染口腔上皮细胞能促进细胞的粘附和增值(P<0.05);Real time-PCR检测E6、E7基因表达量的变化发现,A组细胞相比较B组,其E6,E7 m RNA的表达量是上调的,且差异具有统计学意义(P<0.05)。结论(1)本研究构建的高危型HPV 3个致癌基因重组慢病毒载体能成功转染口腔上皮细胞。(2)单独的高危型HPV E5基因不能促进口腔上皮细胞粘附和增殖,但协同E6和E7基因共同转染时可促进口腔上皮细胞粘附和增殖,并对E6和E7基因m RNA表达量有一定的间接上调作用,这为阐明高危型HPV E5基因与口腔癌的相关性奠定基础。