【摘 要】
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中国是世界上绵羊种类最多的国家,随着全国人口的不断增长和生产科学的进步,人们对于绵羊肉食品的需求越来越大。但日益严重的病害和不断恶化的自然条件给我绵羊养殖业造成了
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中国是世界上绵羊种类最多的国家,随着全国人口的不断增长和生产科学的进步,人们对于绵羊肉食品的需求越来越大。但日益严重的病害和不断恶化的自然条件给我绵羊养殖业造成了重大经济损失。热休克蛋白家族(HSPs)是生物体内的重要抗感染和抗逆基因,HSP60作为HSPs中一个最为保守的大家族,广泛存在于各类生物中,积极参与着机体的应激免疫反应且发挥重要作用,对绵羊HSP60的深入研究有助于我国绵羊养殖业的健康发展。鉴于此,本试验以绵羊HSP60基因为对象,通过Western Blotting和实时荧光定量PCR分别检测HSP60在绵羊不同组织蛋白和基因水平的表达情况,利用免疫组化对HSP60蛋白在不同组织进行定位分析,以2-3月龄绵羊胎儿心肌细胞为对象,构建HSP60过表达载体pIRES2-EGFP-HSP60,合成靶向SiRNA沉默HSP60,进行HSP60基因功能验证。研究结果如下:研究发现(1)通过基因和蛋白两个层面的研究,发现绵羊各组织器官中HSP60表达存在差异;心脏中HSP60基因和蛋白表达量均明显高于其他组织,推测HSP60对维持心脏的正常功能有重要作用。(2)成功构建HSP60过表达载体(pIRES2-EGFP-HSP60),验证发现,过表达组(pIRES2-EGFP-HSP60)HSP60基因水平和蛋白水平表达均高于对照组,RT-qPCR检测细胞增殖标志基因细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、增殖细胞核抗原(PCNA)和抗凋亡基因Bcl-2在24h,48h过表达组(pIRES2-EGFP-HSP60)表达均高于正常组,促凋亡基因Bax在24h,48h过表达组(pIRES2-EGFP-HSP60)表达均低于正常组。(3)合成靶向SiRNA沉默HSP60验证发现,沉默组(SiRNA-HSP60)HSP60基因水平和蛋白水平表达均低于对照组,RT-qPCR检测细胞增殖标志基因细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、增殖细胞核抗原(PCNA)和抗凋亡基因Bcl-2在24h,48h沉默组(SiRNA-HSP60)表达均低于正常组,促凋亡基因Bax在24h,48h沉默组(SiRNA-HSP60)表达均高于正常组。
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