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目的:乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染导致的肝硬化和肝细胞癌等相关疾病的发病率和死亡率持续增加,并且HBV感染传播途径多,发病过程长,发病机制复杂,对人类健康早已产生了严重威胁[1]。目前,抗HBV的药物主要有干扰素（interferon,IFN）和核苷（酸）类似物[necleoside（acid）analogues,Nas]。这两类药物虽能抑制HBV复制,但不能彻底清除肝细胞核内共价闭合环状DNA（cccDNA）,且长期服用会产生毒副作用和耐药性,所以很难达到理想的治疗目的[2]。因此寻找安全高效的治疗药是目前相关科研者的共同目标,我们课题组设计了新型核苷类化合物GY001-GY005。本课题旨在对GY001-GY005这五个化合物进行抗HBV活性筛选,针对活性较好的化合物对其抗HBV机制进行探索,并进行了大鼠血浆中代谢物鉴定实验,为化合物非临床药代动力学提供数据支持。方法:本课题采用人肝癌HepG2细胞、野生型转染HBV基因的HepG2.2.15细胞和对拉米夫定耐药HBV基因的HepGRL1细胞为筛选模型,选用浓度为20μM的拉米夫定（3TC）作为阳性药[3]。以HBsAg和HBeAg为指标对这5个化合物进行体外抗HBV活性比较,并检测其对细胞上清液及细胞内HBV DNA拷贝数的影响,选出活性最好的化合物探讨其抗HBV机制。在此基础上,对活性最好的化合物GY005进行大鼠血浆中代谢物鉴定实验,为此类化合物后期的药代动力学实验奠定基础。本研究共分三部分,其内容如下:第一部分化合物GY001-GY005体外抗HBV活性研究通过四甲基偶氮唑盐（MTT）比色分析法检测化合物对HepG2细胞的毒性,计算半数细胞毒性浓度(CC50);酶联免疫吸附法（ELISA）检测药物作用于细胞6天后上清中的HBsAg、HBeAg的变化,比较5个化合物对HBV抗原表达量的抑制作用;实时荧光定量聚合酶链反应法（Quantitative Real-time PCR,FQ-PCR）检测化合物作用于细胞6天后,化合物对细胞内及细胞上清中HBV DNA拷贝数的影响,计算出化合物对HepG2.2.15细胞和HepGRL1细胞上清中及细胞内HBV DNA拷贝数的抑制率,再与阳性药物抑制率比较,判断其体外抗HBV效果。第二部分GY005抗HBV作用机制研究采用逆转录聚合酶链反应法（Reverse Tanscription PCR,RT-PCR）检测GY005对HepG2.2.15细胞HBV聚合酶（Polymerase,P）基因mRNA表达活性的影响。HepG2.2.15细胞培养于6孔细胞板,设定给药组、阳性组和空白组,6天后收集细胞并提取RNA,反转录后进行RT-PCR,最后对PCR产物进行图像采集并进行半定量分析。第三部分GY005大鼠血浆中代谢物初步鉴定选取SD大鼠,GY005用CMC-Na匀浆,灌胃给药后眼眶采血,分离血浆,通过LC-MS/MS检测其代谢物,对数据分析并与标准品进行比较,从而初步确定代谢物。结果:1.通过MTT法检测,GY001-GY005体外对HepG2细胞的毒性均较小,其CC50均大于500μM。2.ELISA法检测同浓度（1μM）的GY001-GY005对HepG2.2.15和HepGRL1细胞抗原的抑制率,结果显示GY001-GY005对HBV抗原的分泌均有抑制作用,其中GY005活性稍好。3.FQ-PCR法结果显示,GY001-GY005均能显著降低细胞上清液和细胞内HBV DNA水平,且对其拷贝数的抑制率均呈浓度依赖性。对HepG2.2.15细胞给药6天,GY005活性较为突出,1μM的GY005对HepG2.2.15细胞上清和胞内HBV DNA的抑制率分别为81.07%（p<0.01）、71.85%（p<0.01）,3TC组对其抑制率约为75%;对HepGRL1细胞给药6天,作用最突出的依然是GY005,1μM的GY005对HepGRL1细胞上清和胞内HBV DNA的抑制率分别高达72.97%（p<0.01）、80.05%（p<0.01）,3TC组对其抑制率约为20%。4.RT-PCR检测结果表明,与空白对照组和阳性对照组相比,经GY005作用之后的细胞内HBV P基因mRNA条带亮度显著降低。说明GY005可抑制HBV-P基因mRNA的表达。5.LC-MS/MS检测结果表明,大鼠灌胃给药GY005 2h后体内代谢物有GY001、GY002以及GY003,含量都比较少,而原型（GY005）基本完全水解。结论:1.GY001-GY005化合物毒性均较小。2.GY001-GY005化合物具有明显的抗HBV的作用,其中活性最好的是GY005,其作用机制为转录水平抑制HBV P基因mRNA的表达。3.GY005在大鼠体内易水解,水解代谢物有GY001、GY002和GY003。