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苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)042B分离自新疆的和田苜蓿,能够在含0.6mol/L NaCl的FY基本培养基中生长.经Tn5-1063诱变得到042B的转座子插入突变体,从3000多株突变株中得到5株盐敏感变株042BL-1、042BL-2、042BL-3、042BL-4和042BL-5.耐盐性试验表明,它们都不能在含有0.4mol/L NaCl的FY培养基中生长.其中,042BL-4在含有0.3mol/L NaCl的FY培养基上不能生长,042BL-5在含有0.2mol/L NaCl的FY培养基上不能生长.5株盐敏感突变株对于LiCl、KCl和蔗糖都有不同程度的敏感,并能够在苜蓿上结瘤固氮.以转座子内的基因luxAB为探针进行Southern杂交,发现Tn5在这5个突变株中都只有单一拷贝的插入,表明突变株的耐盐表型改变是由于转座子插入诱变造成的.使用转座子挽救法克隆了042BL-2中Tn5插入侧翼的序列.提取042BL-2的基因组DNA,经ClaI完全酶切后,与luxAB探针杂交得到12kb左右的阳性条带.回收12kb的ClaI片段,以pBBR1MCS-2为载体,构建含有转座子及侧翼序列的部分基因文库.通过菌落PCR筛造出阳性克隆,经Southern杂交验证后,以Tn5两端已知的序列设计引物进行测序.测序结果表明,042BL-2中Tn5插入定位在染色体上,位于smc00190基因中.其功能未知,该实验证明它与耐盐有关,命名为rstC基因.RstC蛋白结构域分析表明,此蛋白是一个具有两个跨膜区的跨膜蛋白,在C末端有两个卷曲螺旋,N末端在壁膜间隙形成一个环,这些结构与细菌趋化作用中的传导蛋白的特征结构有一致性,因此认为可能是一个感应细胞外化学物质浓度变化的传导蛋白.使用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)克隆了042BL-1及042BL-4中Tn5插入位点侧翼序列.序列测定与BLAST比较结果表明,042BL-4中Tn5插入在共生大质粒pSymA sma1789的基因中,命名为rstD基因,功能预测rstD基因为可能的腺苷酸环化酶.包括SAM(Sterile Alpha Motif)、腺苷酸环化酶催化结构域和ATP酶结构域,Tn5插入在其ATP酶结构域的编码区.042BL-1中Tn5插入在染色体上基因smc002407中,命名为rstE基因.PCR扩增得到包含启动子的rstD和rstE全长,将其克隆至穿梭载体pBBR1MCS-5上.经三亲本杂交将完整的rstD基因和rstE基因转入突变株042BL-4和042BL-1中,使突变株恢复耐盐性,表明rstD和rstE基因都是与耐盐有关的基因.PCR扩增得到包含rstD基因中腺苷酸环化酶催化结构域(CyaA)编码区的DNA片段,将其克隆至自杀性质粒pJQ2002SK上,然后将卡那盒插入CyaA编码区中,构建成CyaA编码区插入突变的质粒pJQ-cyaA4K.经三亲本杂交将其导入野生菌042B中,在5％的蔗糖选择压力下,得到CyaA编码区的042B突变株.突变株的耐盐性分析表明,与野生型042B相比突变型株的耐盐性并无多大的改变,这说明CyaA编码区的敲除并不影响042B的耐盐性.