肝纤维化主要特征是慢性肝损伤后细胞外基质过度堆积。进展性纤维化的特征是分泌α-SMA的门静脉周围和窦周肌成纤维细胞聚集。持续的炎症通常导致大量的纤维化,最终导致肝硬化,伴随着肝血管的结构扭曲,并为肝脏失代偿、原发性肝癌和死亡奠定基础。肝损伤后,肝脏中主要的胶原合成细胞-肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）被激活,并转化为肌成纤维细胞样细胞,增殖速度更快,显示出更强的趋化性、存活率和胶原生成。肝星状细胞在肝脏炎症转变为纤维化的病程进展过程中也起着重要作用。HSCs的激活是由多种介质驱动的,如趋化因子、活性氧、生长因子、基质刚性、基质细胞蛋白和损伤相关的分子模式,这些介质也由邻近细胞分泌,并以自分泌和/或旁分泌的方式驱动HSC的瘢痕形成。然而,目前抗纤维化治疗的一个局限性是候选药物不能特异性地针对造血干细胞。越来越多的研究发现,除抑制活化HSCs增殖和活化,促进活化HSCs凋亡之外,诱导活化HSCs衰老可以防止肝纤维化进程。因此,了解活化HSCs衰老的分子机制对于开发有效的抗肝纤维化治疗方法具有重要意义。Micro RNAs（mi RNAs）是大约22核苷酸长度的内源性非编码RNA。mi RNAs通过约6-8个核苷酸的序列5’端与靶基因信使RNA内的互补序列之间的碱基配对来识别mi RNAs的靶基因,通过m RNA衰变或通过含有mi RNA的RNA诱导的沉默复合物在转录后水平抑制这些靶基因的表达。哺乳动物mi RNAs参与多种生物学过程,如分化、增殖、抗氧化应激和肿瘤抑制。此外,已知mi RNAs在包括癌症在内的多种疾病中表达失调。由于其基因调控能力,mi RNAs成为极具吸引力的治疗靶点。前期研究发现mi RNA在多种纤维化疾病过程中的具有调控作用。Mi RNA能调控多种肝纤维化的相关因子的表达,反过来,肝纤维化又能导致多种mi RNA表达发生改变。之前,本课题组已证实mi R-708与肝纤维化发生与发展密切相关。然而,大多数研究都集中mi RNAs在HSCs增殖活化上,而对mi R-708如何参与肝星状细胞衰老过程的机制知之甚少,这需要进一步的研究。芍药苷（paeoniflorin,Pae）是白芍总苷的主要活性成分。由于Pae起效慢,生物利用度低,限制了其临床应用。因此,本实验室开发了Pae单体衍生物（monomer derivative of paeoniflorin,MDP）,其生物利用度和功效优于Pae。前期我们研究已经证明MDP可以抑制炎症反应。然而,MDP在肝纤维化中的相关性和潜在机制仍不清楚。目的:1.研究mi R-708、ZEB1和p53对诱导活化HSCs衰老的影响;2.明确mi R-708与ZEB1和ZEB1与p53启动子之间的靶向关系;3.阐明MDP对肝纤维化的治疗作用及其作用机制;4.揭示MDP通过直接作用于Argonaute 2（Ago2）进一步促进mi R-708/ZEB1/p53通路诱导的衰老发挥对肝纤维化的治疗作用。方法:1.购买60只C57小鼠,随机分为6组（正常组,CCl4组,25mg/kg MDP+CCl4组,50mg/kg MDP+CCl4组,100mg/kg MDP+CCl4组,40mg/kg秋水仙碱+CCl4组）,使用CCl4腹腔注射8周构建肝纤维化体内模型;在第二周开始通过灌胃分别给予不同浓度的MDP和秋水仙碱。造模结束后,采用HE,Masson和天狼星红染色对肝脏组织进行病理检测,AST,ALT和TBIL试剂盒对AST,ALT和TBIL活性进行观察。采用IHC和Western blot技术检测α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）,I型胶原（Collagen type1,Col.I）和衰老相关蛋白（p16和p21）表达,观察MDP对肝纤维化的治疗效果;2.在体外,采用TGF-β1（10 ng/ml）刺激人肝星状细胞LX-2构建肝纤维化体外模型,同时给予MDP,采用免疫荧光,q PCR和Western blot技术检测α-SMA、Col.I、p16和p21表达变化;3.采用免疫荧光,q PCR和Western blot技术检测肝纤维化组织中mi R-708,ZEB1和p53表达水平,在体外,采用TGF-β1（10 ng/ml）刺激人肝星状细胞LX-2构建肝纤维化体外模型;免疫荧光,q PCR和Western blot技术检测细胞中mi R-708,ZEB1和p53表达水平观察mi R-708,ZEB1和p53在肝纤维化过程中表达变化;4.在体外采用mi R-708 inhibitor、mi R-708 mimics、p-CMV-ZEB1、ZEB1 si RNA、p53 si RNA和PEX-3-p53分别沉默和过表达mi R-708,ZEB1和p53,采用流式细胞术观察mi R-708,ZEB1和p53对LX-2细胞周期的影响;β-半乳糖苷酶染色试剂盒观察mi R-708,ZEB1和p53对LX-2细胞对β-半乳糖苷酶活性的影响;免疫荧光和Western blot观察mi R-708,ZEB1和p53对活化HSCs衰老标志性蛋白表达的影响;5.在体外共转染mi R-708 mimics和ZEB1 WT-3’-UTR、mi R-708 NC和ZEB1WT-3’-UTR、mi R-708 mimics和ZEB1 MT-3’-UTR、mi R-708 mimics和ZEB1MT-3’-UTR,采用双荧光素酶报告基因试验检测mi R-708和ZEB1之间的靶向关系;6.在体外共同转染ZEB1 si RNA和WT-p53、ZEB1 NC和WT-p53、ZEB1 si RNA和MT-p53、ZEB1 NC和MT-p53。采用双荧光素酶报告基因试验检测沉默ZEB1对p53启动子活性的影响;7.采用Discovery Studio 2017 R2软件中的Lib Dock软件对MDP进行分子模拟对接研究。结果:1.过表达mi R-708可抑制活化LX-2细胞周期阻滞和促进p16和p21表达为了观察mi R-708对活化HSCs衰老的影响,q PCR结果发现,肝纤维化过程中,mi R-708表达降低。紧接着,转染后,流式细胞术结果表明,过表达mi R-708可明显抑制活化LX-2细胞周期进程;β-半乳糖苷酶染色结果表明过表达mi R-708可提高β-半乳糖苷酶活性;免疫荧光和Western Blot结果显示,过表达mi R-708可显著提高p16和p21表达,抑制α-SMA和Col.I的表达,相反,沉默mi R-708可显著抑制p16和p21表达,促进α-SMA和Col.I的表达。2.沉默ZEB1可抑制活化LX-2细胞周期阻滞和促进p16和p21表达为了观察ZEB1对活化HSCs衰老的影响,免疫荧光、q PCR和Western Blot结果显示,ZEB1在活化的HSCs中表达升高。转染后,流式细胞术结果表明,沉默ZEB1可明显抑制活化LX-2细胞周期进程;β-半乳糖苷酶染色结果表明沉默ZEB1可提高β-半乳糖苷酶活性;免疫荧光和Western Blot结果显示,沉默ZEB1可显著提高p16和p21表达,抑制α-SMA和Col.I的表达,相反,过表达ZEB1可显著抑制p16和p21表达,促进α-SMA和Col.I的表达。3.过表达p53可抑制活化LX-2细胞周期阻滞和促进p16和p21表达为了观察p53对活化HSCs衰老的影响,免疫荧光、q PCR和Western Blot结果显示,p53在活化的HSCs中表达降低。转染后,流式细胞术结果表明,过表达p53可明显抑制活化LX-2细胞周期进程;β-半乳糖苷酶染色结果表明过表达p53可提高β-半乳糖苷酶活性;免疫荧光和Western Blot结果显示,过表达p53可显著提高p16和p21表达,抑制α-SMA和Col.I的表达,相反,沉默p53可显著抑制p16和p21表达,促进α-SMA和Col.I的表达。4.ZEB1是mi R-708的候选靶点为了观察mi R-708与ZEB1之间的关系,通过Target Scan预测发现ZEB1是mi R-708的候选靶点,并在ZEB1中找到了mi R-708的互补位点。双荧光素酶报告试验结果表明,过表达mi R-708可明显抑制ZEB1的WT3’-UTR的荧光素酶活性。然而,过表达mi R-708不影响ZEB1的MT 3’-UTR报告载体的荧光素酶活性。q PCR和Western Blot结果表明,过表达mi R-708可抑制ZEB1的表达,而沉默mi R-708可促进ZEB1的表达。5.ZEB1可结合p53启动子区域为了观察ZEB1与p53之间的关系,双荧光素酶报告试验数据显示,与空载体相比,沉默ZEB1可以增加p53启动子中的荧光素酶活性然而,过表达ZEB1可抑制p53启动子的荧光素酶活性。免疫荧光分析、q RT-PCR和Western blot结果显示,过表达ZEB1可明显抑制p53的表达,沉默ZEB1可明显促进p53的表达。6.MDP在体内可以减轻CCl4引起的肝纤维化为了观察MDP对肝纤维化的治疗作用,根据HE、Masson和天狼星红染色结果表明,小鼠肝组织比正常组有更多的脂肪变性、坏死和纤维化间隔。同时,CCl4能显著提高小鼠血清ALT、AST和TBIL活性。此外,α-SMA和Col.I这两种通常被认为是纤维化标志物的蛋白。免疫组化和Western Blot结果显示,小鼠肝纤维化组织中α-SMA和Col.I的表达均明显增强。我们进一步测量衰老标记物是否随着肝纤维化的进展而改变。免疫组化和Western Blot结果显示CCl4抑制p16和p21的表达。更重要的是,我们通过观察MDP（25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg）对CCl4诱导的小鼠肝纤维化的影响。结果表明,MDP能显著抑制肝脂肪变性、坏死和纤维化间隔。而且加入MDP后,ALT、AST和TBIL活性的升高被逆转。此外,随着衰老标志物（p16和p21）表达的升高,α-SMA和Col.I的表达呈剂量依赖性地降低。这些结果一致证明,MDP在体内可以减轻CCl4引起的肝纤维化。7.MDP可促进体外活化的HSCs衰老MTT结果表明,MDP浓度越高毒性越高,并且在10-5mol/L达到临界值。此外,Western Blot结果表明。与对照组相比,TGF-β1可降低LX-2细胞中p16和p21的表达,上调α-SMA和Col.I的表达。然而,MDP(10-8,10-7,10-6,10-5mol/L,24 h)可显著降低LX-2细胞SMA和Col.I的表达,升高p16和p21的表达。更重要的是,高浓度(10-5mol/L)的MDP对TGF-β1诱导的LX-2细胞活力有明显的抑制作用,因此选择10-5mol/L进行进一步研究。接下来,β-半乳糖苷酶染色结果表明,经MDP处理活化的LX-2细胞可见大量β-半乳糖苷酶阳性细胞。免疫荧光、q PCR和Western Blot结果显示,TGF-β1促进α-SMA和Col.I的表达,抑制p16和p21的表达。但MDP可抑制α-SMA和Col.I的表达,上调p16和p21的表达。这提示MDP可促进体外活化的HSCs衰老。8.MDP靶向Ago2间接调节mi R-708抑制肝纤维化为了观察mi R-708与MDP之间的关系,q PCR结果表明,MDP可显著促进mi R-708表达。此外,免疫荧光和Western Blot结果显示,在CCl4诱导的肝纤维化和活化的LX-2细胞中,Ago2的表达受到抑制,在肝纤维化组织和活化的LX-2细胞中加入MDP后,Ago2的表达下降被逆转。q PCR结果发现,Ago2的抑制降低了mi R-708的表达。相反,过表达Ago2可促进mi R-708的表达。此外,Discovery Studio 2017 R2软件分析,发现MDP以折叠的方式与靶蛋白的活性口袋结合。Western Blot结果显示,沉默Ago2基因可增加α-SMA和Col.I的表达,这种增加效果可被MDP抑制。反之,过表达Ago2抑制α-SMA和Col.I的表达,而MDP进一步抑制了α-SMA和Col.I的表达,表明MDP与过表达Ago2具有协同作用。结论:1.mi R-708可靶向抑制ZEB1上调p53可明显促进肝纤维化中的HSCs细胞衰老进而抑制肝纤维化的进程;2.MDP可通过诱导活化HSCs衰老抑制肝纤维化进而对肝脏具有保护作用;3.MDP可通过直接结合Ago2促进mi R-708的表达进一步上调p53诱导HSCs衰老逆转肝纤维化;