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背景与目的淋巴瘤是目前发病率较高的恶性肿瘤之一,严重危害人类健康。结外NK/T细胞淋巴瘤属于成熟T细胞和NK细胞肿瘤中的一种亚型,在西方国家较为少见,但是在亚洲人、墨西哥人和南美土著人中发病率较高。在我国,此病是最常见的淋巴瘤类型之一。结外NK/T细胞淋巴瘤具有独特的临床病理特征,临床具有高度侵袭性,由于病变易复发且对放化疗易出现抗拒,预后总体较差。NK/T细胞淋巴瘤发病机制的复杂性及肿瘤的异质性加大了诊断与治疗的困难。目前国际上没有对标准化的治疗方案达成共识,因此使得病人的个体化治疗难以实现。新的治疗方法比如免疫治疗、分子靶向治疗也在进一步探索及研究中。因此,开展NK/T细胞淋巴瘤的基础和临床研究,为临床提供有效的治疗作用靶点,具有重要意义。Micro RNA(简称mi RNA)是一种长度约22个核苷酸的内源性的非编码单链RNA分子,广泛存在于植物、动物及DNA病毒中,在转录后水平负向调控靶基因的表达。mi RNA的异常表达与肿瘤发生发展密切相关,与蛋白编码基因相同,mi RNA也可扮演癌基因或抑癌基因的角色。很多与细胞增殖、分化、凋亡、侵袭等生物学过程相关的基因被证实为mi RNA的靶基因。最近研究证明,mi RNA异常表达与淋巴瘤的发生发展有着密切关系,mi RNA表达谱的分析在淋巴瘤诊断、分型及治疗靶点的筛选中发挥重要作用。mi R-34a基因定位于染色体1p36,启动子区包括P53结合位点和Cp G岛,由于P53调控失常或Cp G岛甲基化可导致mi R-34a表达异常。在实体瘤的研究中发现,mi R-34a大多表达下调,mi R-34a可以通过靶向调控细胞周期蛋白、细胞周期相关蛋白激酶抑制肿瘤细胞的增殖,还可以通过调控与细胞自噬及衰老有关的细胞调节因子来影响肿瘤进展,因此在大多数实体瘤中,mi R-34a发挥抑癌基因的作用。但是最近有研究发现,在一些EBV阳性的淋巴瘤中由EB病毒潜伏膜蛋白(Latent Membrane Protein l,LMP-1)介导的mi R-34a表达上调,能促进肿瘤细胞增殖,提示mi R-34a发挥致癌作用。因此mi R-34a发挥的生物学功能具有组织特异性。依据我们课题组前期对NK/T细胞淋巴瘤细胞株以及正常NK细胞的小RNA高通量深度测序的研究,发现在SNK-6和YTS细胞中mi R-34a表达下调。而目前关于mi R-34a在NK/T细胞淋巴瘤中的表达及生物学功能的研究未见其他文献报道。本课题利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)技术检测mi R-34a在NK/T细胞淋巴瘤组织中的表达情况,并进一步分析其与患者临床病理特征的关系及预后相关性;通过构建高表达mi R-34a及低表达mi R-34a的重组慢病毒载体并进行包装,经感染NK/T细胞淋巴瘤细胞系后观察肿瘤细胞增殖、凋亡及侵袭情况,研究mi R-34a对体外细胞生物学特性的影响;体内构建NK/T细胞淋巴瘤裸鼠移植瘤动物模型,与体外细胞实验进行比较;通过计算机靶基因预测软件、荧光素酶报告基因实验及western-blot实验确定mi R-34a作用的可能的靶基因,对靶基因进行初步验证,并研究靶基因发挥的生物学功能。课题旨在探讨mi R-34a在NK/T细胞淋巴瘤中的作用及意义,寻找与NK/T淋巴瘤诊治相关的新的有效靶点。第一部分mi R-34a在NK/T细胞淋巴瘤组织中的表达及临床意义方法:1.收集并筛选鼻型NK/T细胞淋巴瘤的石蜡组织标本30例,以10例鼻腔粘膜慢性炎的标本作为对照组织。2.采用q RT-PCR的方法检测NK/T细胞淋巴瘤组织及对照组织中mi R-34a相对表达量。3.用SPSS软件对mi R-34a表达与NK/T细胞淋巴瘤患者临床病理参数的关系进行统计学分析,包括年龄、性别、B症状、血清LDH水平、Ann Arbor临床分期及IPI评分。4.单因素及多因素分析mi R-34a表达及以上临床病理参数与临床预后的相关性。结果:1.与对照组相比,NK/T淋巴瘤组织中的mi R-34a的表达水平明显降低。2.mi R-34a的表达水平与患者年龄及Ann Arbor临床分期有关(P<0.05),而与患者性别、血清LDH水平、B症状及IPI评分无关(P>0.05)。3.mi R-34a的表达与患者总生存率无明显相关性(P>0.05),IPI评分≥3分为患者预后不良的独立危险因素。第二部分mi R-34a对NK/T细胞淋巴瘤细胞系的生物学特性影响方法:1.设计引物,以U6为内参,通过RT-PCR的方法检测正常NK细胞及NK/T细胞淋巴瘤SNK-6和YTS细胞系中mi R-34a的表达量。2.设计合成Pre-mi R-34a片段和anti-mi R-34a片段,同时将慢病毒mi RNA表达质粒p Lenti-mi R和慢病毒mi RNA封闭质粒p Lenti-anti-mi R经过特定酶切位点酶切,与目的片段进行无缝克隆,构建可以上调mi R-34a表达及下调mi R-34a表达的重组慢病毒表达载体。3.将重组慢病毒载体、包装质粒△8.2、包膜质粒VSV-G共转染293T细胞,经过包装产生病毒原液,并进行滴度测定。4.设计四个实验组:空白对照组、阴性对照组、mi R-34a高表达组和mi R-34a干扰组,分别利用MTT法、流式细胞学及Transwell小室实验检测各组感染后的YTS细胞的生长增殖能力、细胞凋亡情况及细胞的侵袭迁移能力。结果:1.mi R-34a在YTS和SNK-6淋巴瘤细胞株中的表达与NK细胞株比较,表达明显下调。2.经过PCR鉴定及测序鉴定,成功构建了可以上调及下调mi R-34a表达的重组慢病毒表达载体p Lenti-mi R-34a和p Lenti-anti-mi R34a。3.MTT实验结果发现,在感染72h后mi R-34a高表达组、mi R-34a干扰组和对照组各组之间两两比较,吸光度均有显著差异(P<0.05)。与对照组相比,mi R-34a高表达组吸光度显著降低,而mi R-34a干扰组吸光度显著升高。4.流式细胞学检测结果发现,mi R-34a高表达组与阴性对照组、mi R-34a干扰组相比,细胞凋亡率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。5.Transwell小室法检测结果发现,mi R-34a高表达组、mi R-34a干扰组和对照组各组之间两两比较,穿膜细胞数均有显著差异(P<0.05),mi R-34a高表达组穿膜细胞数明显减少而mi R-34a干扰组穿膜细胞数明显增多。第三部分mi R-34a靶基因预测及功能初步验证方法:1.利用生物信息学软件Target Scan、Pic Tar和Miranda分别预测mi R-34a作用的靶基因。2.将pmir GLO载体的双酶切产物,与目的基因CD47-3’UTR、MYB-3’UTR、MYC-3’UTR的PCR产物进行无缝克隆,构建重组载体pmir GLO-CD47、pmir GLO-MYB和pmir GLO-MYC。3.设计五个实验组:pmir GLO-CD47、pmir GLO-MYB和pmir GLO-MYC,阴性对照组Pmir GLO-control及空白对照组,分组与Lenti-mi R34a慢病毒共转染293T细胞,进行双荧光素酶报告基因分析。4.设计四个实验组:空白对照组(未感染YTS细胞)、阴性对照组(Lenti-con)、Lenti-mi R34a组和Lenti-anti-mi R34a组,各组感染YTS细胞后,应用RT-PCR检测各处理组CD47m RNA的相对表达量,Western Blot实验检测各处理组CD47蛋白的表达水平。5.设计靶向CD47的sh RNA序列并转染至YTS细胞,RT-PCR及Western Blot实验检测转染后CD47的m RNA及蛋白表达情况。检测分为细胞对照组、阴性对照组、mir34a过表达组和CD47sh RNA干扰表达组,分别利用MTT法、流式细胞学及Transwell小室实验检测各组感染后的YTS细胞的生物学功能。结果:1.生物信息学软件预测CD47、MYB和MYC为mi R-34a可能作用的靶基因。2.经过PCR鉴定及测序鉴定,成功构建了重组载体pmir GLO-CD47、pmir GLO-MYB和pmir GLO-MYC。3.双荧光素酶报告实验结果显示,与对照组相比,pmir GLO-CD47实验组荧光素酶活性明显下降,有统计学差异(P<0.05),而pmir GLO-MYB实验组和pmir GLO-MYC实验组差异不具有显著性(P>0.05)。证明mi R-34a能够与CD47的3’UTR区特异性结合。4.RT-PCR检测结果显示与对照组相比,Lenti-mi R34a组和Lenti-anti-mi R34a组的CD47m RNA表达水平无明显统计学差异(P>0.05)。Western Blot实验结果显示Lenti-mi R34a组、Lenti-anti-mi R34a组与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。Lenti-mi R34a感染组细胞的CD47蛋白表达水平明显低于对照组,而Lenti-anti-mi R34a感染组细胞的CD47蛋白表达水平显著高于对照组。5.转染CD47-sh RNA后,CD47-sh RNA组的CD47m RNA水平及蛋白水平均明显下降,证实慢病毒干扰载体构建成功。MTT实验结果显示,mi R34a组及CD47-sh RNA组与对照组相比,在48h,72h和96h时的细胞吸光度值显著降低,差异有统计学意义(p<0.05)。流式细胞学结果显示,mi R-34a组和CD47-sh RNA组与对照组相比,凋亡细胞数量明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。Transwell小室实验结果显示,mi R-34a组和CD47-sh RNA组较之对照组,迁移穿膜细胞数明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。第四部分mi R-34a对NK/T细胞淋巴瘤裸鼠移植瘤的影响方法:1.建立人NK/T细胞淋巴瘤裸鼠移植瘤动物模型。设计实验组:阴性对照组、Lenti-mi R34a组和Lenti-anti-mi R34a组。观察各组种植瘤生长情况,测量肿瘤体积并绘制生长曲线。实验终止时处死小鼠,分离肿瘤。2.采用HE染色、免疫组化和原位杂交方法检测各组移植瘤病理组织学形态、免疫表型及EBV感染情况。3.采用TUNEL法检测各组移植瘤组织中细胞凋亡率。结果:1.Lenti-mi R34a组裸鼠移植瘤体积明显小于对照组和Lenti-anti-mi R34a组裸鼠移植瘤体积,差异有统计学意义(P<0.05)。2.HE染色显示各组移植瘤大体形态及显微镜下组织学形态相似。免疫组化显示各组移植瘤CD3、CD56、Granzyme-B、TIA-1均表达阳性,CD20表达阴性。EBER原位杂交显示各组移植瘤均EBV阳性。免疫组化结果显示Lenti-anti-mi R34a组裸鼠移植瘤组织中CD47蛋白表达高于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05);Lenti-mi R34a组裸鼠移植瘤组织中CD47蛋白表达明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。3.TUNEL结果显示与对照组和Lenti-anti-mi R34a组相比,Lenti-mi R34a组移植瘤组织中凋亡细胞明显增多,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.mi R-34a在NK/T淋巴瘤石蜡组织及细胞系中的表达均下调,提示其可能参与了NK/T细胞淋巴瘤的发生发展。2.成功构建了可以上调及下调mi R-34a表达的重组慢病毒表达载体,体外实验证实高表达mi R-34a能抑制肿瘤细胞的生长增殖,促进肿瘤细胞凋亡,并减低肿瘤细胞的侵袭转移能力。3.CD47是mi R-34a直接作用的靶基因,mi R-34a能够与CD47的3’UTR区特异性结合进行转录后负向调控,发挥相应生物学功能。4.成功构建了人NK/T细胞淋巴瘤裸鼠移植瘤动物模型,体内动物实验与体外细胞实验结果相似,证明mi R-34a表达上调能够抑制裸鼠移植瘤的生长,促进肿瘤细胞凋亡。5.mi R-34a具有抑癌基因的作用,它可能是一个潜在的分子治疗靶点。