研究背景结直肠癌(colorectal cancer, CRC)无论是在国外还是国内都是常见的恶性肿瘤之一,对人类的健康构成了很大威胁。在西方发达国家,结直肠癌在由恶性肿瘤导致的死亡原因中排第二位,在中国也位居第四位。近年来,CRC的发病率仍具不断上升趋势,尤其是在发达的农村地区和城市,并且发病时间呈年轻化的趋势。因此,深入研究探讨CRC发生发展机制,提高CRC的诊断治疗和改善预后具有重要意义。目前关于肿瘤疾病的研究,大多集中在肿瘤细胞本身,针对肿瘤细胞发生发展机制的研究已经取得一定的进展,关于其表观遗传学和基因间互作的变化在肿瘤中的作用已有比较一致的看法。但随着研究的深入,不断有研究发现,肿瘤的发生发展除了跟细胞本身相关外,还跟肿瘤细胞所处的肿瘤微环境密切相关,无论是在肿瘤的发生、浸润和转移过程中,肿瘤微环境均扮演着重要角色。肿瘤微环境的最重要组成部分是肿瘤间质,而癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)被认为是肿瘤间质中最主要的细胞,研究表明,其与CRC的发生、发展密切相关。CAFs能与肿瘤细胞发生相互作用,从而促进肿瘤的发生发展,这其中涉及到多条信号通路,例如PDGF、TGF-β等,而现今公认的最经典的一条通路为TGF-β信号通路。TGF-β在肿瘤发展的不同时期具有不同作用,例如其在肿瘤发生的早期具有抑癌作用,而到了后期却发挥促癌作用,对于这种现象,目前认为是由于TGF-β所处的环境不同而造成的。在微环境和肿瘤的相互作用过程中,TGF-β1能诱导成纤维细胞活化,转化为表达α-SMA的CAFs,而CAFs具有促进肿瘤细胞发生发展的作用。不管是在体外细胞实验,还是在动物中的实验均表明,TGF-β能诱导正常成纤维细胞活化,从而促进肿瘤的生长。虽然TGF-β通路在肿瘤-间质的相互作用中具有重要作用,并已经引起人们的重视,但关于其发生作用的机制目前还未完全清楚。研究发现,TGF-β能诱导结直肠癌的CAFs表达PGP9.5。PGP9.5(Protein gene product,蛋白基因产物),又称为UCH-L1 (ubiquitin C terminal hydrolase-L1,泛素羧基末端水解酶-1),属于泛素肽羧基末端水解酶类家族,在细胞的水解过程中发挥作用,具有调控细胞进程如细胞周期等功能。PGP9.5首次在神经源性肿瘤中发现,在神经元分化的整个过程广泛表达,被认为是神经源性肿瘤的标志物。但随着研究的深入,结果发现其在多数肿瘤如食管癌、甲状腺髓样癌、胰腺癌、结直肠癌和膀胱癌等也同样呈现高表达。在肿瘤生长过程中,PGP9.5会诱导细胞周期蛋白泛素化的上调,促进细胞的失控性生长,是激活癌基因的关键因素之一。已有研究证实,在由结直肠炎恶变为癌的过程中,PGP9.5发挥着关键作用。在患有结直肠癌的出现淋巴结转移的患者中,PGP9.5呈现低甲基化,表明其与淋巴结转移密切相关。并且PGP9.5表达也与癌的病理期及进展密切相关,PGP9.5表达高的患者生存率下降。因此,PGP9.5在结直肠癌的发生发展过程中具有重要意义。TGF-β能诱导结直肠癌的CAFs表达PGP9.5,但具体机制并不清楚。因此本研究拟进一步探讨其中的具体机制,明确TGF-β具体通过何种信号通路促进CAFs表达PGP9.5,从而对结直肠癌细胞生长发挥调控。此研究的进行可为结直肠癌的诊断、治疗提供新思路和新靶点。研究目的CAFs在肿瘤生长进展中的作用目前已引起足够重视,而TGF-β在CAFs活化过程中的作用也有诸多研究证明,并且PGP9.5在CRC中的重要地位也比较明确。研究表明,TGF-β可以诱导CAFs表达PGP9.5,但具体的分子机制还未有研究报道。因此,本研究针对TGF-β/CAFs/PGP95间的具体作用机制展开研究探讨,明确TGF-β通过何种通路促进PGP9.5在CAFs中分泌表达,从而发挥其促进结直肠癌发生发展的作用。方法和结果第一部分目的：进一步实验验证TGF-β1诱导活化人胚肺成纤维细胞WI-38进一步活化并分泌表达PGP9.5。方法：诱导培养获得活化的人胚肺成纤维细胞WI-38(CAFs),加入TGF-β1刺激,用免疫荧光检测α-SMA的表达。在TGF-β1作用的不同时间点收集细胞和培养基,用Western blot检测PGP9.5表达；同时设计合成靶向TGF-β1的特异siRNA,并构建TGF-β1过表达载体,分别转染活化的人胚肺成纤维细胞WI-38后,Western blot检测PGP9.5表达结果：1. TGF-β1刺激能促进人胚肺成纤维细胞WI-38大量表达a-SMA 。2. TGF-β1作用6h时,PGP9.5在活化人胚肺成纤维细胞WI-38的表达就已经显著上调,随着TGF-β1作用时间的延长,PGP9.5的表达逐渐增加,且差异有显著性,到24h时,TGF-β1促进活化人胚肺成纤维细胞WI-38表达PGP9.5的效果非常明显。3.活化人胚肺成纤维细胞WI-38细胞和培养基中PGP9.5的表达趋势一致：TGF-β1作用12h后,培养基中PGP9.5含量明显增加,到24h时增加更显著。4.当加入特异靶向TGF-β1的siRNA或其抑制剂LY2109761后,活化人胚肺成纤维细胞WI-38PGP9.5的表达显著下调；而转染TGF-β1过表达载体时,其作用和直接加入TGF-β1因子的作用类似,均能显著增强PGP9.5的表达。5.在转染TGF-β1过表达载体的同时加入TGF-β1的抑制剂LY2109761,虽然与对照组相比,活化人胚肺成纤维细胞WI-38 PGP9.5表达仍然上调,但与TGF-β1过表达载体转染组相比,PGP9.5的表达明显被下调。结论：1. TGF-β1能促进人胚肺成纤维细胞WI-38活化。2. TGF-β1能诱导活化人胚肺成纤维细胞WI-38表达、分泌PGP9.5,并呈时间依赖性。3. TGF-β1 siRNA和其抑制剂LY2109761均能抑制PGP9.5在活化人胚肺成纤维细胞WI-38中的表达。4. TGF-β1过表达同样能诱导活化人胚肺成纤维细胞WI-38表达PGP9.5。第二部分目的：明确TGF-β1具体通过何种通路调控PGP9.5在活化人胚肺成纤维细胞WI-38中的表达。方法：设计合成特异靶向Smad通路关键因子Smad2、Smad3的siRNA,分别转染活化人胚肺成纤维细胞WI-38,另外以ERK1/2、P13K、JNK和p38通路的特异抑制剂,加入活化人胚肺成纤维细胞WI-38中阻断相对应的通路,然后加入TGF-β1刺激,细胞培养48h后用Western blot检测活化人胚肺成纤维细胞WI-38中PGP9.5表达。结果：1.靶向Smad2/3的siRNA均可以显著的抑制TGF-β1促进活化人胚肺成纤维细胞WI-38表达PGP9.5作用。2.相对于TGF-β1作用组, Smad2或Smad3的表达抑制均能显著降低TGF-β1促PGP9.5表达的作用,不过PGP9.5表达仍然上调。3.当阻断了ERK1/2和P13K通路后,TGF-β1促PGP9.5表达的效果明显被降低,PGP9.5表达虽有所上调,但与TGF-β1作用组相比,上调效果明显被抑制。4.当阻断JNK和p38通路时,相对于TGF-β1添加组,PGP9.5的表达虽然有所下降,但下调程度并不十分显著,PGP9.5仍然表现出比较高的表达。结论：1.对于活化人胚肺成纤维细胞WI-38,TGF-β1能通过Smad通路调控PGP9.5的表达。2.对于活化人胚肺成纤维细胞WI-38,TGF-β1还能通过ERK1/2和P13K通路促进PGP9.5表达,而JNK和p38通路在其中的作用并不明显。第三部分目的：明确TGF-β1诱导活化人胚肺成纤维细胞WI-38表达的PGP9.5是否对结直肠癌细胞增殖和侵袭能力产生影响。方法：将活化人胚肺成纤维细胞WI-38培养在tran swell小室的上层小室,结直肠癌细胞培养于下层小室,构建共培养模型。当活化人胚肺成纤维细胞WI-38加入TGF-β1时, Western blot检测下层结直肠癌细胞及其培养基中PGP9.5的表达,MTT实验检测结直肠癌细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞的周期和凋亡,用Transwell侵袭实验法检测结直肠癌细胞侵袭能力变化。结果：1.随着TGF-β1作用时间的延长,PGP9.5在下层结直肠癌细胞培养基中的含量显著增多。2.随着TGF-β1浓度的增加,细胞的增殖逐步明显增强。当活化人胚肺成纤维细胞WI-38加入TGF-β1的同时,往结直肠癌细胞中加入PGP9.5抑制剂,此时细胞的增殖相对于对照组仍然增加,但相对于单纯TGF-β1添加组,其增殖率明显被降低。3.当加入TGF-β1到活化人胚肺成纤维细胞WI-38后,结直肠癌细胞凋亡峰(Sub β1峰)的比例显著降低；往结直肠癌细胞中加入TGF-β1的抑制剂时,与对照组比较,Sub G1峰的比例也下降,不过比TGF-β1添加组高。类似的,在结直肠癌细胞中加入PGP9.5的抑制剂时,Sub G1峰的比例相对于对照组也发生下调,但仍然比TGF-β1添加组高。4.活化人胚肺成纤维细胞WI-38加入TGF-β1后,结直肠癌细胞的侵袭能力显著增加。而当活化人胚肺成纤维细胞WI-38加入TGF-β1的同时,往结直肠癌细胞中加入PGP9.5抑制剂后,此时细胞的侵袭能力相对于对照组仍然增加,但相对于单纯TGF-β1添加组,其侵袭能力明显被抑制。结论：1. TGF-β1诱导活化人胚肺成纤维细胞WI-38表达的PGP9.5能促进结直肠癌细胞的增殖,当PGP9.5被抑制时,TGF-β1进一步活化人胚肺成纤维细胞WI-38而促进结直肠癌细胞增殖的作用被明显抑制。2.在TGF-β1作用活化人胚肺成纤维细胞WI-38而抑制结直肠癌细胞凋亡的过程中,PGP9.5发挥了作用,但抑制PGP9.5的作用也未能完全阻断TGF-β1作用活化人胚肺成纤维细胞WI-38后对肿瘤细胞的影响,TGF-β1作用活化人胚肺成纤维细胞WI-38后还有可能分泌其他因子而发挥作用。3. TGF-β1作用活化人胚肺成纤维细胞WI-38后能显著促进肿瘤细胞的侵袭,而PGP9.5在其中发挥关键作用。抑制PGP9.5的作用后,TGF-β1作用活化人胚肺成纤维细胞WI-38而促进结直肠癌细胞侵袭的作用在一定程度上被阻断。实验研究结论：1、TGF-β1能诱导活化人胚肺成纤维细胞WI-38分泌表达PGP9.5并呈时间依赖性。2、TGF-β1主要通过Smad、ERK1/2和P13K通路调控活化人胚肺成纤维细胞WI-38中PGP9.5的表达。3、TGF-β1诱导活化人胚肺成纤维细胞WI-38表达的PGP9.5能促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭,并抑制结直肠癌细胞的凋亡。