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第Ⅰ部分iNOS/NO通路激活与小G蛋白A过表达研究背景及目的：Rho GTP酶(RhoGTPase)又称小G蛋白,是Rho家族众多成员中的一个。它除了在调控肌动蛋白方面起重要作用外,还在其他诸如细胞的收缩、迁移、分化、以及凋亡等多个方面具有重要的调节功能。近年的研究证明RhoA及其下游激酶ROCK共同组成的RhoA/ROCK通路在心血管多种疾病的发生与发展过程中扮演着重要的角色。LPS作为一种致炎性物质,能对血管细胞产生极强的刺激效应,参与从动脉粥样硬化到血管内膜增厚等多种心血管疾病的病理过程。血管平滑肌细胞(VSMCs)中的一氧化氮合酶(iNOS)可被LPS诱导表达,造成iNOS/NO通路的激活。第Ⅰ部分研究旨在阐明LPS刺激对VSMCs活性、增殖状态和RhoA表达水平的影响,同时明确iNOS/NO通路在LPS调控RhoA过程中的作用。研究方法：采用贴壁法原代培养SD大鼠VSMCs,光镜形态学及免疫组化法进行细胞鉴定。MTT(噻唑蓝)法检测不同剂量LPS对VSMCs活性的影响。免疫组化染色计数法测定LPS对细胞增殖力的影响。LPS刺激VSMCs后分别在不同时间点对iNOS活性、NO产物水平进行测定。同时采用RT-PCR测定iNOS mRNA的表达水平、免疫印迹实验测定iNOS蛋白表达水平。LPS刺激后不同时间点测定RhoA蛋白的表达水平。使用iNOS阻断剂L-NIL阻断iNOS/NO通路或使用NO供体SNP激活iNOS/NO下游通路,而后分别测定iNOS活性、NO产物水平、iNOS及RhoA的蛋白表达水平结果与结论：VSMCs形态学及免疫组化法鉴定结果显示贴壁法原代培养的细胞具备VSMCs的正常形态并具有较高的纯度。50μg/ml及以下剂量的LPS对VSMCs的活性无影响。25μg/ml和50μg/ml的剂量均能产生明显的促VSMCs增殖作用,明确了LPS与VSMCs异常增殖性疾病的相关性。10μg/ml的LPS对iNOS/NO通路具有显著的激活作用,使iNOS活性、NO产物含量、iNOS表达水平呈现时间依赖性上升。同时10μg/ml的LPS也使RhoA的表达水平呈现时间依赖性上调。iNOS抑制剂L-NIL能抑制iNOS的活性、下调NO产物水平,并能显著减弱RhoA的过表达。NO供体SNP能够诱发RhoA的过表达,产生与LPS类似的效应。这些结果说明在VSMCs中,iNOS/NO通路参与了LPS诱导的RhoA过表达。增大L-NIL的剂量并未产生更强的逆转效应,提示LPS诱导RhoA过表达除了iNOS/NO途径介导,还有其他途径参与。第Ⅱ部分乙酰水杨酸对小G蛋白A调控作用的研究研究背景及目的：乙酰水杨酸(acetylsalicylic acid, aspirin)在心血管疾病的治疗中有着广泛的应用。近年的研究发现aspirin具有抑制平滑肌细胞增殖、减少炎性因子生成、保护内皮细胞免受氧化应激因素损伤等多重功能。这些多重保护作用不依赖于其对血小板的抑制作用,为非环氧化酶(cyclooxygenase, COX)依赖性作用。RhoA与心血管系统的正常生理功能与异常病理过程有极为密切的关联。本部分研究旨在探明aspirin在分子水平对RhoA异常表达的调控,以及对RhoA蛋白活性、转膜和磷酸化等的影响。研究方法：MTT法测定aspirin对VSMCs活性的影响以确定实验中aspirin的用量。以LPS作为炎性刺激因素,采用Realtime PCR及免疫印迹法测定低剂量与高剂量aspirin对RhoA表达水平的影响。采用Pull-down实验测定低剂量及高剂量aspirin对VSMCs蛋白活性的影响。测定低剂量和高剂量aspirin在炎性刺激及非炎性刺激状态下对RhoA转膜及磷酸化水平的影响。免疫组化染色法观察低剂量及高剂量aspirin对LPS促增殖作用的影响。结果及结论：活性检测结果显示300μmol/L及以下剂量的aspirin对VSMCs的活性不产生影响。低剂量(30μmol/L)与高剂量(300μmol/L)的aspirin均能显著减弱LPS引发的RhoA mRNA水平升高,且两个剂量组的作用无显著差异。蛋白表达分析的结果显示,与30μmol/L的剂量相比300μmol/L的aspirin具有更强的抑制RhoA蛋白过表达的作用。这说明aspirin的非COX依赖性作用至少部分是通过下调RhoA蛋白表达水平进而下调RhoA/ROCK通路活性实现的。LPS刺激后能使活性RhoA(GTP-RhoA)的水平上升约80%。低剂量aspirin对LPS诱导后的RhoA活性升高无影响,高剂量的aspirin能抑制LPS诱导的RhoA活性升高。转膜检测的结果显示LPS能使RhoA的转膜增强,低剂量aspirin与高剂量aspirin对LPS刺激后的转膜无显著影响,提示与转膜相关的调节蛋白未受aspirin的影响。磷酸化水平的检测结果显示LPS孵育后VSMCs的RhoA磷酸化水平上升约60%。两组剂量的aspirin都能显著抑制RhoA磷酸化水平的升高,其中高剂量的aspirin显示了更强的抑制作用。增殖力检测的结果显示高剂量的aspirin能显著抑制LPS的促VSMCs增殖作用,而低剂量的aspirin无此抑制作用。第Ⅲ部分乙酰水杨酸调控小G蛋白A机制的探讨研究背景及目的：Aspirin作为非甾体类抗炎药(NSAIDs)能抑制环氧化酶进而抑制血小板聚集。很多研究发现aspirin具有抗血小板之外的心血管保护作用,但目前aspirin的这种心血管多重保护作用的具体机制尚未阐明。第Ⅱ部分研究结果已明确低剂量和高剂量aspirin均能显著下调RhoA的过表达,第Ⅲ部分研究从不同角度对aspirin下调RhoA过表达的机制进行探讨。研究方法：LPS刺激VSMCs后加入aspirin,测定iNOS活性、NO产物含量以及iNOS蛋白表达水平以明确aspirin对iNOS/NO通路的影响。在aspirin作为干预因素的条件下分别阻断和激活sGC/cGMP/PKG通路,研究该通路在RhoA过表达过程中的作用以及与aspirin下调过表达的关联。采用aspirin、salicylate和indomethacin三种药物进行比对,以明确乙酰化作用以及COX依赖性作用是否是aspirin下调RhoA的功能基础。分别测定aspirin作用下RhoA mRNA以及蛋白的半衰期以明确aspirin对RhoA稳定性的影响。检测aspirin作用下GTP-RhoA在降解过程中的比例,并分析磷酸化及转膜对RhoA降解的影响。研究结果及结论：低剂量aspirin对LPS诱导后iNOS活性、NO产物水平及iNOS蛋白表达水平无影响。高剂量aspirin能下调iNOS活性及NO产物水平,但对于iNOS表达水平无明显影响。说明aspirin(高剂量)对iNOS活性的抑制作用是其多重保护作用的机制之一,但并非是其下调RhoA过表达的主要机制。鸟苷酸环化酶(sGC)抑制剂ODQ抑制sGC/cGMP/PKG通路后使LPS诱导的RhoA水平下降,这种抑制作用能被cGMP类似物8-Br-PET-cGMP所逆转,重又引发RhoA过表达。8-Br-PET-cGMP单独应用能引起RhoA mRNA及蛋白的高表达,产生与LPS类似的作用。8-Br-PET-cGMP上调RhoA的作用能被30μmol/L的aspirin所取消,证明sGC/cGMP/PKG及其下游途径是aspirin调节作用的一个靶点。Aspirin、salicylate和indomethacin三种药物比对的结果发现只有aspirin具有下调RhoA过表达的作用,提示aspirin对RhoA的调节功能基于乙酰化作用。半衰期测定结果显示aspirin对RhoA mRNA的半衰期无影响,但能显著缩短RhoA蛋白的半衰期。说明aspirin抑制RhoA过表达是通过下调RhoA mRNA表达水平和促进蛋白降解两方面的作用来实现的。蛋白降解实验的结果显示RhoA降解过程中,在aspirin作用下GTP-RhoA的比例相对升高。磷酸化分析及转膜分析的结果排除了ser188磷酸化和蛋白转膜这两种保护因素造成GTP-RhoA相对升高的推测,提示GDP-RhoA对aspirin的促降解作用更敏感。