L-茶氨酸(Y-谷氨酰乙基酰胺)是一种独特的非蛋白质氨基酸,天然存在于茶树中。随着研究人员对L-谷氨酰胺的营养价值、生理作用及药用功能等方面研究的不断深入,L-茶氨酸的一系列功能也被人们渐渐熟知,发现它在调节疏缓人脑神经、降低血压等方面效果明显。以L-茶氨酸为原料的一系列产品进一步推动了医药及保健行业的发展。γ-谷氨基甲酰胺合成酶(GMAS)是在噬甲基菌中发现的一类能够催化L-谷氨酸和甲胺合成γ-谷氨基甲酰胺的酶。一些研究表明,某些微生物来源的GMAS对乙胺的亲和力更高,在AIP和Mg2+存在时可催化L-谷氨酸和乙胺合成L-茶氨酸。多聚磷酸激酶(polyphosphate kinase 2,PPK2)是ATP再生用酶,能够催化多聚磷酸和ADP直接转化为ATP。本文使用大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)表达异源的GMAS和PPK2,并利用重组酶耦联催化生产L-茶氨酸。在上述双酶偶联体系的作用下,在pH 8.0,32℃的条件下催化8 h可以形成20.68 g/LL-茶氨酸,摩尔转化率为79.24%。在验证了酶功能的基础上,为了进一步减少反应成本,本文构建了大肠杆菌基因工程菌,通过流加前体物乙胺发酵的方式得到L-茶氨酸。在大肠杆菌E.coli W3110基因组上通过单拷贝木糖启动子PxylF控制的,来源于T7噬菌体的RNA聚合酶基因T7RNAP,双拷贝T7启动子控制的来源于Methylovorusmays的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas,得到了一株无质粒的,遗传稳定的,用于L-茶氨酸生产的基因工程菌E.coli gmas2。通过优化工程菌的发酵条件,经过20 h发酵L-茶氨酸产量可以达到30.45 g/L,糖酸转化率可以达到20.17%。根据L-茶氨酸的物化性质拟定出合适的分离提取路线。首先通过微滤膜和超滤膜组合去除发酵液中的菌体、蛋白质和色素;其次使用活性炭进一步去除浓缩液的色素,使透光度达到精制要求;最后使用浓缩冷乙醇析晶的方法获得了 L-茶氨酸晶体。经核磁检测成品合格,整个过程提取收率可达到70.34%,成品纯度可达到98.51%。