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【研究背景】肺动脉高压(pulmonary hypertension,PH)是一种以肺动脉压力增高为特点的临床综合征,定义指海平面静息状态下,平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure,m PAP)≥20mm Hg。早期无明显症状,仅表现肺血管阻力增加,晚期会出现肺血流量减少、右心衰竭甚至死亡。本病特点为病因众多、患病率高、起病隐匿、死亡率高,主要的病理改变为内皮细胞凋亡、血管重构、远端肺血管闭塞,血管重构主要由平滑肌细胞的增殖、迁移引起。传统的治疗主要是增强心肌收缩力、利尿、扩张肺血管、缓解症状和增强运动能力,而更好的治疗应为改善内皮功能、减轻增厚的血管壁,逆转肺血管的重构。目前针对肺血管的靶向药物主要用于第一类肺动脉高压和慢性血栓栓塞性肺动脉高压,可减轻症状、延长生存时间,但也有价格贵、副作用多等缺点。因此仍需进一步寻找新的靶向药物。我们课题组前期研究发现,硼替佐米(Bortezomib,BTZ)对肺动脉高压大鼠模型有显著治疗作用,在低氧和野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠模型中,BTZ可显著降低右室压力、改善肺血管重构,其分子机制为通过抑制肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)中经典瞬时受体蛋白1,6(TRPC1,6)的表达,从而抑制钙池操控性钙内流(SOCE)并降低PASMCs内的基础钙。然而,其具体的调控机制仍有待发掘。近年来越来越多的文献报道,Caveolin-1是一种重要的SOCE调控蛋白,是PASMCs中钙离子动态平衡的重要参与者。研究发现,低氧上调的Caveolin-1表达,引起肺动脉平滑肌细胞中SOCE及基础钙离子增高,介导细胞由收缩型向增殖型转变。因此在本研究中,我们进一步探讨BTZ是否同样靶向Caveolin-1对PASMCs的的钙稳态进行调控,并进一步调控细胞的增殖。【研究目的】建立原代培养的大鼠PASMCs模型,通过RT-q PCR及Western blot,分别观察BTZ对Caveolin-1转录水平和蛋白表达的影响;通过蛋白合成抑制剂放线菌酮(Cycloheximide,CHX)阻断新生蛋白合成,观察BTZ对Caveolin-1降解途径的影响;已知Caveolin-1通过溶酶体途径降解,氯喹为溶酶体途径抑制剂,观察氯喹(Chloroquine,CHQ)对Caveolin-1的影响;BTZ、CHQ对低氧诱导的PASMCs增殖的影响;BTZ、CHQ对低氧PASMCs基础钙及SOCE的影响。【研究方法】1、大鼠远端肺动脉平滑肌细胞的培养用3%戊巴比妥钠麻醉雄性成年SD大鼠(250g左右),分离大鼠远端肺动脉(3级以外),仔细去除外膜,纵向剪开肺动脉血管,刮去内皮细胞,在细胞台上用滤菌后的胶原酶消化,接种于10cm培养皿中,鉴定的细胞接种于含有玻片的35mm培养皿中,用含用含10%血清的低糖DMEM培养5-6天。用免疫荧光标记肺动脉平滑肌细胞中的α-actin及细胞核(YO-PRO-1标记),荧光显微镜下观察5个不同视野,进行细胞计数,计算细胞纯度。2、免疫印迹实验弃掉不同实验组的培养基,用4度预冷的PBS冲洗2遍,加入含PMSF的RIPA裂解液,摇床上冰上裂解30分钟,用细胞刮收取培养皿中的细胞。4度离心收集蛋白上清液。用BCA法测定蛋白浓度,等量蛋白上样后,用10%SDS-PAGE胶电泳,将分离胶中的蛋白电转到PVDF膜上,5%脱脂奶粉的TBST封闭2小时,加入一抗4°C过夜孵育,TBST洗3次,10-15min/次,加入二抗常温孵育1小时,倒掉二抗,TBST洗3次,10-15min/次,加入发光液曝光。3、荧光定量PCRTrizol法提取PASMCs总RNA,根据TAKARA公司RT试剂盒,将RNA逆转录为c DNA,按照TAKARA公司荧光定量PCR试剂盒进行荧光定量PCR反应,通过单峰溶解曲线判断产物的特异性。4、细胞增殖实验用96孔培养皿培养细胞,每实验孔中加入10μl CCK8试剂,37°C常氧培养箱孵育4小时,用酶标仪在450nm波长处测定细胞吸光度值。5、细胞钙离子测定将原代肺动脉平滑肌细胞培养至25mm原形盖玻片上,处理后加入fura-2荧光染料,培养箱孵育1小时,用荧光显微镜测定340/380荧光强度的变化,反应细胞内钙离子浓度的变化。【实验结果】1、硼替佐米(BTZ)短时间处理(3、6、12小时)对Caveolin-1的蛋白表达量的影响无统计学意义,而24小时或60小时处理均可显著下调Caveolin-1蛋白和m RNA的表达(P<0.05)。2、在使用蛋白合成抑制剂放线菌酮(Cycloheximide,CHX)阻断新生蛋白合成的情况下,BTZ可使Caveolin-1的蛋白表达量进一步降低,且有统计学意义(P<0.05),通过时间点试验验证,BTZ可加快低氧条件下肺动脉平滑肌细胞中Caveolin-1的降解。3、已知Caveolin-1蛋白经由溶酶体途径降解。但当我们用氯喹(CHQ)处理后发现,CHQ短时间处理(3、6、12小时)对Caveolin-1的蛋白表达量的影响无统计学意义,而24小时或60小时处理均可显著下调Caveolin-1蛋白和m RNA的表达(P<0.05),其机制可能为抑制了Caveolin-1的转录。4、在细胞增殖实验中:BTZ、CHQ均可抑制低氧平滑肌细胞增殖,但联合使用较单用无累加效果。5、在细胞钙离子测定实验中,低氧大鼠远端PASMCs中基础钙及SOCE较常氧增高,BTZ、CHQ可降低基础钙及SOCE,但联合使用未进一步降低。【实验结论】蛋白酶体抑制剂硼替佐米可以通过抑制转录和促进蛋白降解的方式来下调低氧诱导的小凹蛋白Caveolin-1的表达,进而抑制低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖。