论文部分内容阅读
本研究应用RT-PCR技术，从两株分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞株2E3和1A8中，分别扩增出抗体VH和VL基因，用linker（Gly4Ser）3基因，将VH和VL基因连接成单链抗体（ScFv）基因，并将其克隆至pGEM-T载体中。经核苷酸序列分析证实，VH和VL基因及linker基因拼接正确，ScFv-2E3基因全长为726bp，编码242个氨基酸，VH基因序列位于linker基因的上游，大小为357bp，编码119个氨基酸残基；VL基因序列位于linker基因的下游，含有324bp，编码108个氨基酸残基；linker基因大小为45bp，编码15个氨基酸残基（Gly4Ser）3；ScFv-1A8基因全长为729bp，编码243个氨基酸，VH基因序列位于linker基因的上游，大小为351bp，编码117个氨基酸残基，VL基因序列位于linker基因的下游，含有333bp，编码111个氨基酸残基，linker基因大小为45bp，编码15个氨基酸残基（Gly4Ser）3。经计算机软件分析，VH和VL基因均为新发现的基因序列，符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征。ScFv-2E3的VH和VL基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ（B）和轻链κⅢ家簇；而ScFv-1A8的VH和VL基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ（A）和轻链κⅥ家簇。 将两种抗A型产气荚膜梭菌α毒素ScFv基因ScFv-2E3和ScFv-1A8分别克隆至表达载体pUC119、pET20b、pET28a和pHOG21中，构建了重组质粒pUC-2E3和pUC-1A8，pET20b-2E3和pET20b-1A8，pET28a-2E3和pET28a-1A8以及pHOG-2E3和pHOG-lA8，然后分别转化至受体菌JM105、BL21（DE3）和XL1-BLUE中，得到重组菌株JM105（pUC-2E3）和JM105（pUC-1A8）、BL21（DE3）（pET20b-2E3），BL21（DE3）（pET20b-1A8），BL21（DE3）（pET28a-2E3），BL21（DE3）（pET28a-1A8），XL1-BLUE（pHOG-2E3）和XL1-BLUE（pHOG-1A8）。ELISA检测表明：经IPTG诱导后所表达的目的蛋白存在于重组菌株JM105（pUC-2E3）和JM105（pUC-1A8）及XL1-BLUE（pHOG-2E3）和XL1-BLUE（pHOG-1A8）的菌培养上清中，在重组菌株BL21（DE3）（pET20b-2E3）和BL21（DE3）（pET20b-1A8）以及XL1-BLUE（pHOG-2E3），XL1-BLUE（pHOG-1A8）的胞周质中也检测到了ScFv的存在。经SDS-PAGE分析表明，蛋白表达产物在BL21（DE3）（pET28a-1A8），BL21（DE3）（pET28a-2E3）和XL1-BLUE（pHOG-2E3）中均形成了包涵体的形式，而且在重组菌株XLI－BLUE(pHOG－2E3人XLI－BLUE（pHOG－IAS）的胞周质中出现了特异的蛋白带。经薄层扫描分析：重组菌株XL IBLUE(pHOG－2E3＊XLI－BLUE（pHOG－IAS人BLZI（DE3）（pET20b－2E3）禾 BLZI（DE3）（pET20b AS）的蛋白表达产物分别占菌体可溶性蛋白的4％、3％、0．9％和 0．7％，重组菌株 XLIBLUE切HOG上E3）的蛋白表达产物占菌体总蛋白的相对含量为22％，其相对分子量约为31 KD。 对ScFv的生物学特性研究表明：ScFv蛋白不但具有中和卵磷脂酶的活性，而且还能够对致死性腹腔攻击的小鼠产生良好的被动保护作用。