原发性肝癌（primary carcinoma of the liver，PCL）是临床中最常见的恶性肿瘤之一，死亡率居于癌症死亡率第二位。甲胎蛋白（alpha fetoprotein,AFP）是目前临床诊断原发性肝癌的重要生物标志物，然而约三分之一的肝癌患者血清AFP检测呈阴性，也有部分肝硬化患者血清长期呈 AFP阳性。因此，继续深入研究肝癌发生发展的分子机制，寻找新的特异性肿瘤标志物及诊断、治疗靶点，具有重要的临床应用价值。　　前期工作中，我们课题组利用消减SELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXpotential Enrichment）技术，成功地从伴肝外转移的AFP阴性肝细胞癌（Hepotacellular carcinoma）患者血清中，筛选出了候选标志物分子Vasorin（VASN）蛋白。进一步实验证明了VASN在肝细胞癌组织、肝癌细胞中的表达水平均高于正常对照，提示我们VASN可能是肝细胞癌的新型肿瘤标志物。　　人VASN蛋白，又称Slit-Like2（SLITL2）蛋白，属于典型的Ⅰ型跨膜糖蛋白，其胞外结构域经去整合素-金属蛋白酶17（a disintegrin and metalloprotease17, ADAM17）剪切、脱落，成为可溶性形式。人VASN蛋白在主动脉的血管平滑肌细胞有较高水平的表达，在肾脏、胎盘组织也有表达，此外，多种乳腺癌细胞也表达、分泌VASN蛋白。VASN蛋白的相关文献较少，通过文献调研我们发现，可溶性VASN（soluble VASN，sVASN）蛋白可以结合TGF-β，抑制其介导的上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）。而VASN蛋白是否具有其它生物学功能，有待深入研究。　　后续的研究过程中，我们实验室对 VASN蛋白的生物学功能进行了初步探讨。体外实验结果表明，人肝癌细胞HepG2培养上清的外泌体中含有VASN蛋白；并且 HepG2细胞来源的外泌体中的VASN蛋白水平明显高于正常肝细胞L02；HepG2细胞分泌的外泌体形式 VASN蛋白可以转运至人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）中，促进HUVEC细胞的迁移。然而，HepG2培养上清中还存在大量的sVASN蛋白，sVASN是否具有类似的生物学功能尚不明确。本文拟研究sVASN蛋白的生物学功能及其可能的分子作用机制。　　我们首先利用原核系统重组表达sVASN蛋白（rhsVASN-His）。在前期的实验中，我们构建了pET28a-sVASN重组质粒，获得了包涵体表达的rhsVASN-His 蛋白。本研究中，我们将 sVASN基因克隆至本室构建的pET28a-DsbA-DsbAm载体中，转化大肠杆菌BL21（DE3），在IPTG诱导下获得了可溶性表达的目的蛋白。在纯化过程中，摸索了多种纯化条件，包括不同超声条件、缓冲体系、纯化介质等，以Ni2+柱纯化效果较为适宜，获得了纯度尚可的目的蛋白，但纯化效率低。目前仍在进行纯化方法的优化工作。　　为了进一步研究sVASN的生物学功能，我们需要相应的抗体，而商品化的sVASN抗体较少，不能满足研究的需要。因此，前期工作中，我们以重组表达的rhsVASN-His为抗原，委托公司制备了十余株sVASN单克隆抗体。本研究中，我们选择培养了其中两株亲和力强的杂交瘤细胞、制备腹水并进行了纯化。通过ELISA等实验检测了其特异性和亲和力，结果显示这两株单抗特异性高、亲和力强，可应用于ELISA、Western免疫印迹、免疫共沉淀和细胞免疫荧光等实验，为后续对sVASN生物学功能的进一步探讨提供了有力的工具。　　我们前期工作表明，HepG2细胞来源的外泌体VASN能够促进HUVEC细胞迁移，因此，本研究的关注重点在于探讨sVASN是否也具有相似的功能。我们提取了 HepG2细胞培养上清中的外泌体并收集了去除外泌体的培养基，Western免疫印迹实验检测VASN含量，结果显示培养上清中的VASN蛋白以可溶性形式为主。为了进一步探讨其生物学活性，我们购买了人胚肾细胞HEK293T表达的sVASN蛋白（rhsVASN），通过MTT实验、划痕愈合实验检测了其对HUVEC细胞迁移和增殖的影响，结果显示rhsVASN能够促进HUVEC细胞的迁移和增殖。我们以正常HepG2、过表达/沉默VASN的HepG2细胞培养上清作为条件培养基，与HUVEC细胞共培养，结果显示培养上清中的sVASN同样能够促进HUVEC细胞的迁移和增殖。另外，前期工作中，我们还通过消减SELEX在AFP阴性的肝细胞癌患者血清中钓取到了转铁蛋白受体（transferrin receptor1,TFR1,CD71），该蛋白与VASN是否存在相互作用引起了我们极大的兴趣。本研究中，我们利用rhsVASN-His蛋白和sVASN抗体进行免疫共沉淀实验，从HUVEC细胞膜蛋白中钓取到了TFR1，提示我们二者之间可能存在相互作用。进而，我们进行了sVASN进入HUVEC细胞的内化实验，结果显示，加入转铁蛋白（tansferrin，TF）竞争结合TFR1或沉默TFR1均可减少sVASN的内化，表明sVASN可能通过TFR1途径内化。相关研究还在深入进行中。　　此外，为了后续研究工作的开展，我们尝试采用基因编辑技术CRISPR/Cas9构建了VASN基因稳定敲除的细胞株。我们将guide RNA（gRNA）克隆至pCAS-guide载体中，VASN左右同源臂基因及潮霉素B抗性基因克隆至pBackZero-T载体中，两重组质粒共转染HepG2细胞，通过潮霉素B抗性筛选敲除VASN基因的单克隆细胞株，经过Western免疫印迹实验及基因组PCR分别在蛋白表达和基因组水平对筛选出的单克隆细胞株进行鉴定，获得了3株稳定敲除VASN基因的HepG2单克隆细胞株，。　　综上所述，本研究前期工作的基础上，对sVASN的生物学功能进行了初步研究，并且初步探讨了相关的分子机制。我们的研究结果显示，真核表达的rhsVASN蛋白、HepG2细胞培养上清中天然形式的sVASN均可以促进HUVEC细胞的迁移与增殖；sVASN与 HUVEC细胞表面TFR1相互作用，TFR1介导sVASN内化至细胞内。本研究首次发现了sVASN的非TGF-β依赖的、TFR1信号通路介导的生物学功能，为深入阐释VASN在肝癌发生发展中的作用提供了新线索。