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梨（Pyrus L.）属于蔷薇科植物,是国内外栽培的大宗果树之一。梨果皮色泽有绿色、黄绿色、黄色、褐色和红色,其中红皮梨因其果皮颜色鲜艳、富含花青苷类物质深受消费者的青睐。植物中花青苷的积累呈现昼夜节律性变化,在梨等大多数果树中花青苷生物合成的昼夜节律性调控还不清楚。本研究以‘红早酥’梨（Pyrus cv.‘Hongzaosu’）果皮为主要试验材料,其他梨品种‘红丝绸’（Pyrus communis L.cv.‘Red Silk’）、‘红巴’（Pyrus communis L.cv.‘Red Bartlett’）、‘红蓓蕾莎’（Pyrus communis L.cv.‘Red Palacer’）和‘早酥’（Pyrus cv.‘Zaosu’）作为辅助试验材料,鉴定并探究了两个MYB类转录因子PbREVEILLE1b、PbREVEILLE6（简写为PbRVE1b和PbRVE6）和其下游调控因子PbbHLH2在梨花青苷昼夜节律性积累中的调控作用,为研究梨花青苷昼夜节律性合成和梨果皮着色提供新的理论依据及参考。主要研究结果如下:1.梨果皮花青苷的积累及合成结构基因的表达呈现规律性的昼夜变化。‘红早酥’梨果皮的花青苷主要在夜间积累,白天花青苷积累呈现先升高后降低的变化,且白天的净积累量基本为零。此外,果皮中花青苷合成结构基因（Pb DFR、Pb ANS和Pb UFGT）的表达水平在夜间迅速升高,但日出后降低、在白天维持较低的表达水平,呈现规律性的昼夜交替变化;而花青苷相关的典型MYB转录因子Pb MYB9、Pb MYB10和Pb MYB10b的表达量并无这种现象。因此,这三个MYB转录因子并不是形成花青苷昼夜节律性合成的关键因子。2.花青苷合成结构基因的表达水平与PbRVEs基因的表达水平相关。PbRVEs的表达变化具有昼夜节律性,其中PbRVE1a、PbRVE1b、PbRVE7和PbRVE8的表达量在一天的黎明时分达到高峰点,随后下降至日落时分趋于平缓,这个变化以24小时为周期重复出现。‘红早酥’梨果皮中PbRVE3和PbRVE6的表达量在白天呈现先升高后降低的变化,这个变化同样以24小时为周期重复出现。PbRVEs转录因子的表达量与花青苷合成结构基因的表达量之间存在显著相关性。基因表达分析结果表明,PbRVEs表达的时间并不相同,PbRVE1a、PbRVE1b、PbRVE7和PbRVE8在夜间高表达,而PbRVE3和PbRVE6主要在白天表达。3.PbRVE1b和PbRVE6促进花青苷合成结构基因的表达与梨果皮花青苷的合成。过表达PbRVE1b和PbRVE6使梨果皮中花青苷含量显著增加,花青苷合成结构基因的表达量上升。利用病毒介导的基因沉默系统在梨果皮上沉默PbRVE1b,果皮表面并不能着色,进一步表明PbRVE1b是促进梨果皮花青苷合成的关键转录因子。PbRVE6虽然促进花青苷的积累,但沉默该基因后果皮表面恢复红色,花青苷含量并无明显变化,这表明PbRVE6在促进花青苷积累中的作用能够被其他转录因子所互补。进一步通过酵母单杂交和双荧光素酶分析试验发现PbRVE1b通过结合Pb DFR和Pb ANS的启动子并激活其转录活性来促进花青苷的合成。而PbRVE6通过结合Pb ANS和Pb UFGT的启动子并激活其转录活性来促进花青苷的合成。4.PbbHLH2在转录水平响应PbRVE1b和PbRVE6的调控,促进梨果皮花青苷的合成。系统进化分析筛选出五个IIIf亚家族的PbbHLHs转录因子,对五个PbbHLHs进行表达分析发现PbbHLH2的表达水平呈规律性的昼夜变化,并且PbRVE1b和PbRVE6的表达影响了PbbHLH2基因的表达水平。通过蛋白序列比对分析发现,PbbHLH2蛋白除basic-helix-loop-helix结构域外还存在一个MYB-interacting region（MIR）结构域。通过瞬时表达体系对PbbHLH2的基因功能进行验证,发现过表达PbbHLH2后花青苷的含量增加,花青苷合成结构基因的表达水平上调。利用病毒介导的基因沉默系统在梨果皮上沉默PbbHLH2,果皮表面并不能着色,进一步表明PbbHLH2是促进梨果皮花青苷合成的关键转录因子。PbbHLH2通过MIR结构域与Pb MYB9或Pb MYB10互作形成复合体,且该复合物通过结合Pb DFR、Pb ANS和Pb UFGT的启动子并激活其转录活性以促进梨果皮花青苷的合成。此外,通过Y1H和双荧光素酶分析试验,验证了PbRVE1b和PbRVE6能结合PbbHLH2的启动子并激活其转录活性。因此,PbRVE1b、PbRVE6和PbbHLH2三个转录因子形成调控花青苷昼夜合成的网络,协同调控梨花青苷的昼夜节律性合成。