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【研究背景】丙戊酸钠(Valproate,VPA)是一种用于治疗包括癫痫、慢性疼痛及双相情感障碍等多种神经和神经精神疾病的常用药物。临床及动物实验发现,VPA可导致体重增加等代谢性紊乱伴脂肪肝的症状。多项研究证实VPA可以改变血清中葡萄糖、胰岛素和瘦素等代谢分子及激素的水平,并引起胰岛素抵抗,这与VPA引发的肥胖密切相关。还有研究发现VPA可导致下丘脑多种神经递质水平的改变,提示VPA在食物摄入和体重的中枢神经调控中发挥重要作用。VPA是一种组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)抑制剂,可诱导组蛋白乙酰化和DNA去甲基化,参与基因表达的表观遗传调控。在下丘脑中,VPA已被证实可调节多个基因表达,可能与下丘脑功能异常和体重增加有关,但具体的机制仍有待深入研究。近年来研究发现,肥胖相关FTO(Fat mass and obesity associated)基因多态性与食欲及体重调节密切相关。Fto基因过表达小鼠表现出食欲增强及肥胖现象,而敲除小鼠呈现瘦的表型。本课题组近期证实了下丘脑FTO的稳态表达在体重动态平衡调节中的重要作用。另一项研究发现VPA可诱导小鼠海马组织FTO蛋白表达上调,由此推测VPA也很可能上调下丘脑FTO表达,参与VPA诱导的体重增加有关。【研究目的】本研究拟分析下丘脑细胞及组织中VPA通过诱导组蛋白H3/H4乙酰化打破下丘脑Fto基因的自我负反馈调控环路,并促进转录因子TAF1与Fto基因启动子的结合来增强该基因的转录活性,以期揭示VPA导致下丘脑FTO上调的表观遗传调控机制,分析其与体重及摄食增加的相关性。【研究方法】1.体外实验:(1)采用qRT-PCR和Western blot实验检测VPA处理的下丘脑GT1-7细胞中Fto mRNA及FTO蛋白的表达水平。(2)采用Western blot检测VPA或组蛋白乙酰转移酶p300抑制剂C646处理GT1-7细胞中组蛋白H3/H4乙酰化水平。(3)采用染色质免疫共沉淀(ChIP)方法检测VPA处理后GT1-7细胞中TAF1和FTO与Fto基因启动子的结合情况。2.在体实验:(1)体重及摄食检测:正常饮食及添加VPA喂食C57BL/6小鼠至第13周;添加VPA喂食及腹腔注射C646小鼠2周;添加VPA喂食Fto敲除及野生型小鼠2周,每天记录体重及摄食量。(2)采用qRT-PCR和Western blot检测对照及VPA处理2周小鼠下丘脑组织中Fto mRNA和FTO的表达。(3)Western blot检测下丘脑组织中H3/H4乙酰化水平。(4)ChIP方法检测下丘脑组织中TAF1和FTO与Fto启动子的结合情况。【研究结果】1.qRT-PCR及Western blot结果显示,随着VPA剂量逐渐增加,GT1-7细胞中Fto的mRNA及FTO蛋白水平逐渐升高,表明VPA能够诱导GT1-7细胞Fto基因表达上调。2.与对照相比,VPA处理GT1-7细胞中Ac-H3(Ac-H3/H3)和Ac-H4(Ac-H4/H4)的比例随着VPA的剂量增加而逐渐上升;而组蛋白乙酰转移酶p300抑制剂C646可以逆转VPA的作用效果。从而证实VPA通过促进组蛋白H3/H4乙酰化来上调Fto基因表达。3.ChIP-PCR结果显示,VPA可削弱FTO对自身基因启动子的结合,同时增强转录因子TAF1的结合,最终促使Fto基因表达上调。4.VPA处理小鼠的体重及摄食从第2周开始直至第13周均显著高于对照小鼠,表明VPA能通过促进小鼠食欲来促进体重增加。5.与VPA单独处理小鼠相比较,VPA联合C646处理小鼠的体重及摄食显著下降。表明C646可以逆转VPA对体重及摄食的影响。6.进一步研究表明,VPA可显著性增强下丘脑FTO表达,促进组蛋白H3/H4乙酰化,以及削弱FTO对自身基因启动子的结合,并增强TAF1的结合;而VPA联合C646可以逆转VPA的上述一系列作用效果。从而证实VPA通过表观调控途径阻断Fto基因的自反馈环路来上调下丘脑FTO表达。7.与对照Fto基因敲除小鼠相比较,VPA处理Fto基因敲除小鼠的体重与摄食均无显著性变化,表明FTO参与VPA诱导小鼠体重和食量的增加效应。【结论】上述研究结果表明VPA通过促进组蛋白H3/H4乙酰化打破Fto负反馈调节环路,进一步上调下丘脑FTO蛋白的表达,并导致小鼠体重和食量的增加。本研究揭示VPA通过表观调控途径来上调Fto基因表达,在体重及摄食增加的中枢神经调控作用中发挥重要作用。