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中蜂囊状幼虫病(Chinese sacbrooddisease),简称中囊病,是中蜂饲养中常见的,也是最重要的病害,具分布广、传播快、危害大的特点。其病原为中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV),该病原对幼虫有很高的毒力,导致幼虫或前蛹大量死亡,蜂群衰亡;CSBV同时也可感染中蜂成年工蜂,但无明显外部表现。目前,对中囊病的研究主要以幼虫对象为主,在成年蜂的研究较少,对病毒在成蜂中的感染进程还不了解。同时,蜜蜂中的另一种重要病原:东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae,Nc)在中蜂群中也普遍存在,主要感染成蜂,造成寿命缩短,生产力下降。众所周知,成年工蜂是蜂群中最重要的哺育和生产力量,工蜂的健康对蜂群的生存、繁育和生产有举足轻重的意义。一直以来,对两种病原的研究多是从单一病原的角度进行。而越来越多的研究表明,在一群蜂中,甚至在同一只成年工蜂中,多种病原同时感染的现象并不在少数。因此,本文对CSBV在中蜂成年工蜂中的感染进程进行了研究,并与在意蜂成年工蜂中的感染进程作了对比;同时,就CSBV和Nc双重感染对成年工蜂的影响作了研究。主要结果如下:(1)以 9.25×1011、1.85×1011、3.70×1010拷贝(下文对应简称为 1/2、1/10、1/50浓度组)的CSBV分别接种0日龄和4日龄的中蜂、意蜂成年工蜂,于温箱(35℃±1℃,55%±5%RH)内饲养,结果显示:接种10d时,1/50浓度组的存活率显著低于空白对照(P=0.005)、1/10浓度组(P=0.032),其余各组间的存活率无显著差异(P>0.05)。4日龄中蜂接种5d时,1/10浓度组的存活率显著低于1/2浓度组(P=0.033),其余各处理组之间均无显著差异(P>0.05)。10d时,1/10浓度组的存活率极显著低于1/50浓度组、1/2浓度组和空白对照组(P<0.01),1/50浓度组的存活率显著低于1/2浓度组(P<0.05),与对照组之间无显著差异(P>0.05)。0日龄意蜂工蜂接种病毒5d、10 d时,1/50浓度组的存活率显著低于空白对照(P<0.05),但同时它也显著低于1/10、1/2浓度组(P<0.05)。4日龄意蜂在接种不同浓度的CSBV5 d和10 d时,各组间的存活率之间均无显著差异(P>0.05)。这些结果说明,CSBV并不是造成10日龄工蜂死亡的主要原因。(2)给0日龄和4日龄中蜂工蜂、意蜂工蜂分别接种不同浓度的CSBV后,用定量PCR方法对工蜂中肠中CSBV的病毒量(拷贝数)进行了测定。结果表明,0日龄中蜂工蜂和意蜂工蜂接种CSBV2 d后,中肠中病毒量显著增加(P<0.01),但2-10 d之间,病毒量并无显著增加(P>0.05)。4日龄中蜂工蜂和意蜂工蜂接种不同浓度病毒2 d后,1/2浓度和1/10浓度组的病毒量显著升高(P<0.05)。说明,对于0日龄和4日龄成蜂,接种后2d是病毒在中肠增殖的主要时间,并已达到阈值,不再增殖,所以在之后的检测中未发现病毒量有增加。(3)为了了解CSBV中成年工蜂中的增殖情况,分别对0日龄和4日龄中蜂、意蜂成年工蜂接种后2、6、10 d的中肠CSBV的增殖量进行比较,结果说明,CSBV在中蜂中肠中的感染进程与工蜂接种日龄有关,日龄小,更易感染,病毒增殖的更快。意蜂工蜂在接种相同浓度病毒第2d后,只有1/10浓度组的病毒量有显著增加(P<0.05);第6d后,只有1/2浓度组病毒量有显著增加(P<0.05),但1/50浓度组病毒量在2-10 d之间均无显著增加(P>0.05);1/10浓度组和1/2浓度组在接种第10 d后,0日龄工蜂中肠中的病毒增殖量显著高于4日龄工蜂的增殖量(P<0.05),说明对于意蜂工蜂而言,只有感染的病毒量达到一定阈值时CSBV在意蜂中肠中的感染进程才与工蜂接种日龄有关,出现跟中蜂的一样规律。换言之,CSBV在意蜂中肠中的感染进程比在中蜂中慢,即CSBV可能对意蜂工蜂的致病性较弱。(4)分别对接种病毒后的6日龄和10日龄的中蜂、意蜂工蜂中肠中CSBV的增殖量进行比较,结果显示:对于6日龄中蜂工蜂而言,0日龄时只有接种1/2浓度组的中蜂工蜂中肠中病毒增殖量显著高于4日龄时接种的病毒增殖量(P<0.05)。对于10日龄中蜂工蜂而言,0日龄时接种1/10浓度组和1/2浓度组的中蜂工蜂中肠中病毒增殖量显著高于4日龄时接种的病毒增殖量(P<0.05)。说明,相同日龄的中蜂工蜂和意蜂工蜂中肠中的CSBV增殖量是不同的。(5)为了解中蜂成年工蜂中,中囊病与东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae,Nc)的感染情况,选取表观有中蜂囊状幼虫病症状(简称“有症状群”)和表观无中蜂囊状幼虫病症状(简称“无症状群”)的中蜂各10群,每群随机取样10只,共200只,进行两种病原调查,结果显示:显微镜下检测微孢子虫感染率,有症状群显著高于无症状群(P<0.05),但用定量PCR技术检测的微孢子虫感染率,二类蜂群均有较高的感染率,且二者无显著差异(P>0.05),表明定量PCR方法的灵敏度比镜检方法灵敏。定量PCR法检测表明,微孢子虫总感染率为98.5%,CSBV总感染率为90.1%,混合感染率为89%,表明中蜂工蜂中两种病原的单独感染及混合感染情况均很严重。(6)在室内条件下,给0日龄的中蜂工蜂分别接种不同浓度的CSBV和Nc,分单病原、双重病原感染组、对照组,观察接种后23 d内的中蜂工蜂死亡情况,结果显示:接种病原的试验组存活率显著低于空白对照组。双病原感染下蜜蜂的存活率低于单感染病原(P<0.05),且5000 Nc组存活率显著高于混合接种组(5000 Nc组+1/2 CSBV浓度组),说明CSBV和NC之间可能存在相互作用关系。(7)分别对0、6、12 d中蜂工蜂中肠中CSBV病毒量进行测定,结果显示:中蜂工蜂在双病原存在下,接种6 d后,东方蜜蜂微孢子虫不影响病毒在中蜂工蜂中肠的增殖,病毒量只与病毒的接种浓度有关,随病毒接种浓度的增高而增高。当肠道微孢子虫数量达到一定量时,可能会抑制CSBV在肠道的增殖。(8)分别对0、6、12 d中蜂工蜂中肠中def-J基因和中蜂工蜂胸(去除中肠的)腹中作基因的相对表达水平进行测定,结果显示:CSBV对Vg的表达影响起主要作用,但双重感染下,10000Nc和1/2浓度组下,Nc却会抑制Vg的表达,机体免疫机制受到破坏,进一步说明,Nc与CSBV存在相互作用,Nc通过抑制CSBV的表达进而影响Vg的表达。而病原进入机体后,机体def-1表达显著提高,且Nc的作用高于CSBV,说明Nc和CSBV之间存在相互作用。