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星形胶质细胞(astrocyte AS)是一类大胶质细胞,其数量在中枢神经系统(centrol nervous system CNS)内占绝对优势,在神经元的发育、正常生理及病理过程中都有重要作用,其功能异常会导致神经元变性疾病或者神经退行性疾病发生。目前星形胶质细胞的体外研究主要通过分离脑组织获取原代星形胶质细胞,整个分离过程繁琐耗时,且分离得到的细胞或因动物组织批次间差异而细胞特性不同,导致后续研究过程中数据波动性大且重复性差。而星形胶质细胞作为原代细胞在体外培养时只能传10代左右,其有限的增殖能力限制了很多研究的开展,尤其是长期效应性研究。因此构建一株永生化星形胶质细胞系非常具有实用价值。本实验通过慢病毒将人端粒酶逆转录酶亚基(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)基因介导进入星形胶质细胞,激活端粒酶活性,延长端粒长度以期获得性状良好的永生化小鼠大脑星形胶质细胞系。获得主要结果如下：胰酶消化、低速离心、传代纯化获取原代细胞,培养细胞呈梭形或者多边形,形态均匀,增殖旺盛,贴壁性和折光性好,胞体伸展有突起,星形胶质细胞特异性蛋白GFAP免疫荧光染色呈阳性。成功构建过表达质粒pCDH-CMV-hTERT-EF1-copGFP, PCR扩增、双酶切验证以及测序结果均鉴定正确。采用工具细胞293T包装病毒,浓缩病毒上清液得病毒浓缩液,滴度检测达到5.12×108 TU/mL～15.37×108 TU/mL。用慢病毒介导将hTERT基因整合到第4代小鼠大脑星形胶质细胞基因组,流式分选GFP阳性细胞,挑选细胞克隆并扩大培养,获得状态良好、增殖旺盛的细胞株,目前传至70代。取第55代做hTERT免疫荧光染色,结果呈阳性,而原代星形胶质细胞呈阴性,表明hTERT在hTERT-KMAS中稳定表达,说明外源基因已成功转染到小鼠大脑星形胶质细胞中并稳定表达。对hTERT-KMAS进行生长曲线测定和细胞周期检测,结果显示相比较于原代星形胶质细胞,其具有更快的生长速率和更强的增殖活性；核型分析实验结果显示hTERT-KMAS呈现正常小鼠染色体核型(2n=40)；端粒长度检测结果表明其端粒长度稳定,而且长度与小鼠肝癌H22细胞没有明显差异,说明其端粒酶表达强度趋于稳定；软琼脂实验显示该细胞系在软琼脂中不能形成细胞克隆,表明该细胞依然保留贴壁生长和细胞通讯依赖。综上所述,本实验分离培养并传代纯化小鼠大脑星形胶质细胞,将人端粒酶逆转录酶基因hTERT成功导入并整合到星形胶质细胞基因组中,稳定表达并诱导细胞端粒酶激活,延长端粒长度并维持稳定,使细胞实现永生化,最终成功构建永生化小鼠大脑星形胶质细胞系,为后续研究奠定了基础。