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侵袭和转移在肺癌的进展和预后中起着至关重要的作用,也是肺癌的主要致死因素和治疗失败的主要原因。由于肺癌难以早期诊断,具有高转移率和高复发率等特征,最终导致患者的高病死率。A549细胞系为人体肺腺癌上皮细胞系,长期以来被作为研究肺癌发病机制的细胞模型。H460细胞系为人大细胞肺癌细胞系,与A549细胞系在形态学上都属于上皮细胞,在生长方式上都属于贴壁生长。已有证据表明,细胞内钙离子的释放和细胞质内钙的动态平衡是细胞迁移的重要调节因素之一。但时至今日,关于钙信号与人肺癌细胞系A549和H460细胞迁移的相互关系鲜有报道。ERP44(endoplasmic reticulum resident protein44)是一个内质网腔内调控IP3R1(inositol1,4,5-trisphosphate receptor1)功能的蛋白,己在很多文献中被报道过。关于ERP44在调节细胞迁移中的作用和机理是未知的,特别是在A549和H460细胞系上。
目的:本文以A549和H460细胞作为模型,观察钙离子活动信号在细胞迁移中的作用,以及ERP44在细胞迁移中的影响,探索对细胞迁移进行深入的研究。
方法:采用Western blot、实时荧光定量PCR、腺病毒载体构建、微丝荧光标记、钙成像、细胞划痕实验以及transwell等方法。
结果:利用钙离子螯合剂EGTA螯合胞外钙,得到EGTA可抑制A549和H460细胞的贴壁及粘附。2-APB作为IP3Rs的抑制剂,显著抑制ATP诱导的钙释放,在划痕和transwell实验中抑制A549和H460细胞迁移。同时,划痕和transwell实验联合Phalloidin-FITC标记骨架蛋白F-actin证实了2-APB是通过抑制A549和H460细胞极化进而抑制细胞运动。通过腺病毒载体构建ERP44过表达的细胞模型,发现了ERP44过表达在细胞A549和H460中明显抑制了ATP诱导的IP3Rs释放钙,显著改变了细胞A549和H460的形态,抑制了细胞A549和H460的迁移;Real-time PCR和Westem实验结果证实了在细胞A549和H460上过表达的ERP44可激活相应的信号通路,引起内质网应激标志物(GRP78和CHOP)在mRNA和蛋白水平上表达上调。瞬时下调ERP44抑制了细胞A549和H460迁移,但对GRP78的表达没有影响。稳定下调ERP44不能影响细胞A549和H460的迁移以及GRP78在两个细胞系上的表达。综合以上结果,证明了ERP44过表达导致GRP78上调并不是单一因素引起的,可能是多通路综合作用的结果;后续实验通过对细胞骨架的观察,发现了ERP44过表达会抑制细胞A549和H460骨架伸展,这种状况是EMT的逆过程。在研究ERP44过表达对细胞A549和H460行为学影响的特异性及相关机制的时候,添加了SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系作为对照细胞系,因为已有文献报道过SH-SY5Y特异表达IP3R1,实验结果证实了ERP44过表达不能影响SH-SY5Y细胞的迁移。Westem Blot实验结果说明了在细胞系SH-SY5Y上梯度过表达的ERP44不影响GRP78的表达。RT-PCR的实验结果阐述了IP3Rs的三个亚型IP3R1,IP3R2和IP3R3均在细胞A549和H460中表达;利用三个亚型相应的siRNA干扰后,划痕和transwell实验结果显示IP3R2对A549和H460细胞在运动上的影响最为显著,IP3R1和IP3R3仅有轻微的抑制作用。
结论:本研究初步揭示了ERP44的表达与细胞A549和H460迁移之间的互相关系,证实ERP44主要通过IP3R2对A549和H460细胞迁移发生影响。
目的:本文以A549和H460细胞作为模型,观察钙离子活动信号在细胞迁移中的作用,以及ERP44在细胞迁移中的影响,探索对细胞迁移进行深入的研究。
方法:采用Western blot、实时荧光定量PCR、腺病毒载体构建、微丝荧光标记、钙成像、细胞划痕实验以及transwell等方法。
结果:利用钙离子螯合剂EGTA螯合胞外钙,得到EGTA可抑制A549和H460细胞的贴壁及粘附。2-APB作为IP3Rs的抑制剂,显著抑制ATP诱导的钙释放,在划痕和transwell实验中抑制A549和H460细胞迁移。同时,划痕和transwell实验联合Phalloidin-FITC标记骨架蛋白F-actin证实了2-APB是通过抑制A549和H460细胞极化进而抑制细胞运动。通过腺病毒载体构建ERP44过表达的细胞模型,发现了ERP44过表达在细胞A549和H460中明显抑制了ATP诱导的IP3Rs释放钙,显著改变了细胞A549和H460的形态,抑制了细胞A549和H460的迁移;Real-time PCR和Westem实验结果证实了在细胞A549和H460上过表达的ERP44可激活相应的信号通路,引起内质网应激标志物(GRP78和CHOP)在mRNA和蛋白水平上表达上调。瞬时下调ERP44抑制了细胞A549和H460迁移,但对GRP78的表达没有影响。稳定下调ERP44不能影响细胞A549和H460的迁移以及GRP78在两个细胞系上的表达。综合以上结果,证明了ERP44过表达导致GRP78上调并不是单一因素引起的,可能是多通路综合作用的结果;后续实验通过对细胞骨架的观察,发现了ERP44过表达会抑制细胞A549和H460骨架伸展,这种状况是EMT的逆过程。在研究ERP44过表达对细胞A549和H460行为学影响的特异性及相关机制的时候,添加了SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系作为对照细胞系,因为已有文献报道过SH-SY5Y特异表达IP3R1,实验结果证实了ERP44过表达不能影响SH-SY5Y细胞的迁移。Westem Blot实验结果说明了在细胞系SH-SY5Y上梯度过表达的ERP44不影响GRP78的表达。RT-PCR的实验结果阐述了IP3Rs的三个亚型IP3R1,IP3R2和IP3R3均在细胞A549和H460中表达;利用三个亚型相应的siRNA干扰后,划痕和transwell实验结果显示IP3R2对A549和H460细胞在运动上的影响最为显著,IP3R1和IP3R3仅有轻微的抑制作用。
结论:本研究初步揭示了ERP44的表达与细胞A549和H460迁移之间的互相关系,证实ERP44主要通过IP3R2对A549和H460细胞迁移发生影响。