【摘 要】
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目的：原核表达细胞穿膜肽pep-1和病毒巨噬细胞炎症蛋白-Ⅱ（viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ）的融合蛋白pep-1-vMIP-Ⅱ,并检测该融合蛋白是否具有穿透细胞膜从而发挥激活多种抗HIV-1基因表达上调的功能。为vMIP-Ⅱ发展成为一种新型的、易于给药的防治艾滋病新药提供基础数据。 方法：以KSHV基因组为模板,PCR扩增出vM
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目的：原核表达细胞穿膜肽pep-1和病毒巨噬细胞炎症蛋白-Ⅱ（viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ）的融合蛋白pep-1-vMIP-Ⅱ,并检测该融合蛋白是否具有穿透细胞膜从而发挥激活多种抗HIV-1基因表达上调的功能。为vMIP-Ⅱ发展成为一种新型的、易于给药的防治艾滋病新药提供基础数据。 方法：以KSHV基因组为模板,PCR扩增出vMIP-Ⅱ的开放阅读框。将化学合成的细胞穿膜肽pep-1和vMIP-Ⅱ基因克隆入原核表达载体pET15b,构建原核表达载体的pET15b-pep-1-vMIP-Ⅱ质粒和对照载体pET15b-vMIP-Ⅱ。重组质粒转化大肠杆菌BL21 （DE3） plysS, IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot鉴定表达产物,Ni-NTA琼脂亲和层析纯化回收目的蛋白。分别取10μg/mL的融合蛋白pep-1-vMIP-Ⅱ和不含穿膜肽序列的对照组蛋白vMIP-Ⅱ处理Hela细胞,激光共聚焦显微镜观察该融合蛋白的穿膜功能。以200nmol/l的融合蛋白和对照蛋白同时分别处理HMEC-1细胞和Jurkat细胞,收集细胞,抽提总RNA,荧光定量PCR检测抗HIV基因（MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F）的表达情况。 结果：成功构建了原核表达载体pET15b-pep-1-vMIP-Ⅱ和pET15b-vMIP-Ⅱ, DNA序列比对分析表明表达载体具有正确的序列和阅读框。表达并纯化出可溶性pep-1-vMIP-Ⅱ融合蛋白及vMIP-Ⅱ蛋白。激光共聚焦显微镜观察结果显示：融合蛋白pep-1-vMIP-Ⅱ能穿透细胞膜进入细胞核内,vMIP-Ⅱ蛋白不能进入细胞核内。荧光定量PCR结果显示：融合蛋白pep-1-vMIP-Ⅱ能使Jurkat细胞中抗HIV基因MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F分别上调3.36、2.21、1.40、2.09、2.72倍；使HMEC-1细胞抗HIV基因MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F分别上调57.80、158.63、97.29、2.18、2.43倍。vMIP-Ⅱ蛋白能使Jurkat细胞中抗HIV基因MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F分别上调9.70、22.03、1.59、1.79、1.85倍；使HMEC-1细胞抗HIV基因MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F分别上调57.77、159.66、108.77、2.36、2.31倍。两种蛋白在Jurkat和HMEC-1细胞中上调ARGS的表达的功能无显著差异。 结论：成功在大肠杆菌中诱导表达出融合蛋白pep-1-vMIP-Ⅱ,融合蛋白pep-1-vMIP-Ⅱ能够穿透细胞膜进入细胞核内,pep-1-vMIP-Ⅱ与vMIP-Ⅱ蛋白激活多种抗HIV-1基因表达功能无显著差异。
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