论文部分内容阅读
目的： 采用Illumina Solexa高通量测序技术，探讨系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE）患者大剂量糖皮质激素冲击治疗前后三个不同时间点（治疗前、治疗后第一个月、治疗后第三个月），外周血T细胞TCRβ链CDR3受体库的特征和变化。 方法： 1从遵义医学院附属医院肾病风湿科住院患者中，根据美国风湿病学会2011年修订的SLE诊断标准和SLEDAI活动指数评分标准，遵从患者知情同意原则下，筛选2名SLE活动期志愿患者。 22例SLE活动期的志愿患者：Patient1（P1）；Patient2（P2），在糖皮质激素冲击治疗前、治疗后第一个月和治疗后第三个月时，每次采集外周血量5ml，同时检测患者外周血白细胞数量及抗核抗体谱水平。 3分离各外周血液样本中单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC），分别提取各样本的总 DNA。各样本序号命名为：P1-0：患者1治疗前样本；P1-1：患者1治疗后一个月样本；P1-3：患者1治疗后三个月样本；P2-0：患者2治疗前样本；P2-1：患者2治疗后一个月样本；P2-3：患者2治疗后三个月样本。 4按照人T细胞TCRβ链CDR3受体库建库原理，采用多重PCR技术对各样本的总DNA CDR3区扩增建库，采用Illumina Solexa高通量测序技术分别测定这三个不同时间点的TCRβ链 CDR3受体库基因序列（建库和测序由美国华盛顿医学院Adaptive Biotechnologies immunoSEQ完成）。 5 T细胞TCRβ链 CDR3受体库的组成和特征分析：测序后所得各个样本的序列转化为FASTA格式（又称Pearson格式，为核苷酸序列或氨基酸序列的格式），提交至IMGT/HighV-QUEST在线软件，对上传后得IMGT summary文件，分析各样本T细胞TCRβ链 CDR3受体库的克隆多样性，TRBV、TRBJ基因家族分布及CDR3区的特征变化等。 结果： 12例SLE志愿患者三个时间点血清抗核抗体水平： P1-0：抗ds-DNA抗体(+++)、抗RNP/SM抗体（++）、抗SSA抗体（++）； P1-1：抗ds-DNA抗体(+++)、抗RNP/SM抗体（++）、抗SSA抗体（++）； P1-3：抗ds-DNA抗体(+++)、抗RNP/SM抗体（+++）、抗SSA抗体（+++）； P2-0：抗ds-DNA抗体(+)、抗RNP/SM抗体（-）、抗SSA抗体（-）； P2-1：抗ds-DNA抗体(+++)、抗RNP/SM抗体（++）、抗SSA抗体（+）； P2-3：抗ds-DNA抗体(++)、抗RNP/SM抗体（+++）、抗SSA抗体（-）。 2例SLE志愿患者三个时间点白细胞数目： P1-0：WBC7.3×109个/L、P1-1：WBC4.7×109个/L、P1-3：WBC7.1×109个/L；P2-0：WBC5.8×109个/L、P2-1：WBC3.6×109个/L、P2-3：WBC7.9×109个/L。22例SLE志愿患者三个时间点，PBMC的总DNA，在琼脂糖凝胶电泳图上，每个样本 DNA预测位置均出现清晰的条带。样本经美国华盛顿医学院 Adaptive Biotechnologies ImmunoSEQ检测，六个样品各个总DNA量达2ug以上，符合建库和Illumina Solexa高通量测序要求。 3六个样本 T细胞 TCRβ链 CDR3高通量测序原始序列数：原始序列总数/总Productive序列数/独特的CDR3序列数，分别是：P1-0：884760条/731401条/34130条； P1-1：1539362条/1268445条/38849条； P1-3：1654320条/1371381条/23553条；P2-0：1219887条/994323条/24527条；P2-1：811161条/660616条/22632条；P2-3：979612条/794783条/32190条。 4六个样本TCR CDR3受体库克隆多样性变化： 4.1六个样本的反辛普森指数，数值分别是P1-0：393.0113；P1-1：423.7155；P1-3：346.8453；P2-0：1725.220656；P2-1：159.3978332；P2-3：495.7108618。 4.2六个样本中出现高频增殖克隆(Highly expanded clones，HEC）为：P1-0：0.0440％；P1-1：0.0440%；P1-3：0.0637%；P2-0：0.0082%；P2-1：0.0442%；P2-3：0.0093%。 4.3 P1和P2在治疗前后出现的CDR3区共同的高频克隆增值序列：P1治疗前后均存在且对应不同的TRBV/TRBJ基因家族序列：CASSRTVSNQPQHF； CASSYNHEQYF；CASSVVGNTEAFF。P2治疗前后均存在且对应不同的TRBV/TRBJ基因家族序列：CASSPRTSYEQYF。两例SLE志愿患者在治疗前后三个时间点的高频克隆增值序列中都存在共同的E-Q-Y氨基酸基序。 5六个样本TCR CDR3受体库克隆序列分析结果： 5.1六个样本优势取用的TRBV家族： P1在治疗前后均是优势取用的家族有TRBV28、TRBV19、TRBV2，治疗前、后没有发现取用丢失和新出现的家族。P2在治疗前后均是优势取用的家族有TRBV2、TRBV28、TRBV20-1，而TRBV12-4、TRBV7-1为治疗后第一个月新出现家族。两例志愿患者三个时间点均优势取用TRBV28、TRBV2基因家族。 5.2六个样本优势取用的TRBJ家族： 在治疗前后均是优势取用的家族有TRBJ2-7、TRBJ1-1、TRBJ1-5、TRBJ1-2、TRBJ2-1。P2在治疗前后均是优势取用的家族有TRBJ2-7、TRBJ1-1、TRBJ2-1、TRBJ1-2、TRBJ2-3。两例SLE志愿者三个时间点T细胞受体库均优势取用TRBJ2-7、TRBJ1-1、TRBJ2-1、TRBJ1-2基因家族，都无TRBJ基因家族的取用丢失现象。 5.3六个样本优势取用的TRBV-TRBJ家族配对： P1治疗前后均存在优势配对的是TRBV28-TRBJ1-5、TRBV28-TRBJ2-7、TRBV6-2-TRBJ2-7。P2治疗前后均存在优势配对的是TRBV2-TRBJ2-7、TRBV28-TRBJ2-7。P1与P2治疗前后均有高频配对家族TRBV28-TRBJ2-7。 5.42例SLE志愿患者T细胞CDR3长度分布：P1在治疗前后的CDR3长度均是以12或13个AA长度为主的钟形分布。P2治疗前和治疗后一个月是以13个AA为主，在治疗后一个月出现以11个AA的异常高取用，治疗后三个月以11个AA为主，呈钟形分布。5.52例SLE志愿患者治疗前后样本的CDR3区氨基酸均高频取用以丝氨酸（S）为代表的羟基类、极性中性（亲水性）氨基酸。 5.62例SLE志愿患者治疗前后CDR3区的重叠结果：P1治疗前后均重叠的序列数为1466条，P2治疗前后均重叠的序列数为559条。 结论： 1在血清学检测水平，两例SLE活动期患者治疗后的各项临床检验学的指标，出现好转倾向，但是2例SLE志愿患者之间，每个SLE志愿患者不同时期的各T细胞TCRβ链CDR3受体库的多样性表现不一致，提示可能与自身反应性T细胞的应答程度相关。 2本实验通过对SLE志愿患者治疗前、后TCRβ链CDR3受体库中TRBV、TRBJ基因家族优势取用和配对，CDR3区长度分布、氨基酸取用和重叠率的组成特征及动态变化对比分析，获得两例SLE志愿患者治疗前后三个不同时间点外周血TCRβ链CDR3库特征和变化的数据，提示其与SLE患者对大剂量糖皮质激素冲击治疗的免疫应答存在一定相关性，可为治疗前、后患者T细胞应答状态和水平提供评估基础数据。 3实验从2例SLE志愿患者筛选到的高频克隆增殖TCRβ链 CDR3氨基酸基序（motif），可能与识别相应的特异性抗原有关，符合该病缓解与复发交替发生的疾病特征，可为SLE免疫发病机制和个体化诊治的进一步研究提供新的思路和手段。