论文部分内容阅读
目的：探索独立生长因子Gfi1在髓系细胞增殖和凋亡中的作用,为骨髓增殖性疾病(MPD)的分子学诊断和治疗提供理论依据。方法：(1)通过绿色荧光蛋白GFP慢病毒载体包装系统把目的基因Gfi1和对照组空质粒Plox稳定转染入依赖白介素3(IL-3)生长的小鼠32D粒-单祖细胞细胞株中,无菌流式分选出32D/Gif1和32D/Plox细胞株。(2)通过细胞生长、集落生长和细胞周期的变化等实验来分析32D/Gfi1和32D/Plox细胞株增殖的变化；(3)IL-3撤退实验后,通过流式细胞术、细胞染色(碘化丙啶和Hoechst 33258)、蛋白免疫印迹(WB)等技术来分析32D/Gfi1和32D/Plox细胞株凋亡的变化。结果：(1)稳定转染Gfi1的细胞株(32D/Gfi1)和集落与对照组空质粒Plox的细胞株(32D/Plox)和集落的增殖差异明显,32D/Gfi1细胞增殖速度和集落形成率均明显高于32D/Plox细胞株；过表达Gfi1可以促使32D细胞由G0/G1期进入S期,加速细胞周期进程。(2)IL-3撤退48小时后,流式细胞术分析结果显示：32D/Plox细胞出现的凋亡显著多于32D/Gfi1细胞(分别为89.72%和34.52%,P<0.01)；Western blot结果显示：相对于32D/Plox组,32D/Gfi1组的凋亡促进因子Bax和细胞周期依赖性激酶抑制基因(CDKN2A)编码的两种周期抑制蛋白(p16INK4a和p14ARF,以下简称P14,P16)的水平明显下调。结论：在小鼠32D粒-单核祖细胞株中,Gfi1能够促进细胞增殖、增加集落形成率和加速细胞周期进程；Gfi1能够抑制与细胞周期和凋亡相关的Bax、p16INK4a和p14ARF的表达,从而减少因IL-3撤退引起的32D细胞凋亡。目的：建立小鼠骨髓增殖性疾病(Myeloproliferative disorders, MPD)小鼠模型,探讨独立生长因子(growth factor independence 1, Gfi1)在MPD发病中的作用与机理。方法：选择DBA小鼠,实验动物按移植物不同随机分为3组,A组10只,B组20只,C组4只。移植当天将受鼠置于无菌笼内接受直线加速器亚致死剂量4.0Gy,进行照射,每只小鼠照射后4h内由尾静脉输注入移植物,每只受鼠输入细胞体积为200μl；每只小鼠输入的细胞数1.8×106个；A组输入32D/plox细胞,B组输入32D/Gfi1细胞,C组只做照射,不输细胞,留正常未处理小鼠做血象检测的对照。检测血象、检查嵌合体植入、观察肝、脾、骨的病理改变；Western-blot检测32D/plox小鼠和32D/Gfi1组小鼠Gfi1与JAK2的表达变化。结果：实时定量PCR检测Gfil mRNA在32D/plox小鼠和32D/Gfi1小鼠中的表达,后者显著增高,提示移植物成活；通过Y染色体上的sry基因的PCR扩增检测阳性也说明移植32D/Gfi1细胞成功。血象在30d、60d可检测到32D/Gfi1组小鼠的WBC、RBC、Plt显著增加,明显高于32D/plox小鼠和正常小鼠的血象,且差异有统计学意义(P<0.05),且以后持续保持在较高的血象水平,符合MPD的血象表现。32D/Gfi1小鼠肝脏、脾脏、骨髓的病理改变均符合MPD改变；32D/Gfi1组小鼠表达的Gfi1的mRNA、蛋白及JAK2的mRNA、蛋白比空白载体32D/plox组明显增强。结论：建立了稳定的MPD小鼠动物模型,过表达Gfi1通过增加JAK2的表达促使MPD的发生。目的：探讨骨髓增殖性疾病(myeloproliferative disorders, MPD)患者骨髓中独立生长因子(growth factor independence 1,Gfi1)的表达及其与临床预后的关系。方法：选择华中科技大学同济医学院附属同济医院医院确诊的74例MPD患者为研究对象,其中真性红细胞增多(polycythaemiavera, PV)23例、原发性血小板增多症(essential throm bocythaemia, ET)49例,特发性骨髓纤维化(idiopathic myelofibrosis,IMF)2例。应用逆转录-聚合酶链反应技术扩增Gfi1引物,琼脂糖凝胶电泳结果,分析各组MPD患者Gfi1阳性表达与MPD临床预后的关系。结果：74例MPD患者中52例检出Gfi1阳性表达,分别为PV患者78.26%(18/23)阳性表达,ET患者67.35%(33/49)阳性表达,IMF患者50%(1/2)阳性表达。Gfi1水平增高影响患者的预后,Gfi1阳性表达者,预后较差。结论：Gfi1可作为判断MPD预后的重要指标。