论文部分内容阅读
研究背景及目的 原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC，简称肝癌)是我国常见的恶性肿瘤之一，严重的威胁着人们的健康。虽然甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)可用于人群筛查及诊断，但是，AFP单独诊断肝癌的灵敏度在70％左右，早期诊断肝癌仍存在较大困难，多数肝癌发现时已经失去手术机会。因此人们一直在寻找其他灵敏、特异的生物标志物以便于肝癌的早期诊断。 生物标志物是检测肿瘤的重要工具，一个有临床应用价值的标志物应该在体液(血清、尿液、唾液等)中很容易检测到。基因突变，基因转录和翻译中的改变以及蛋白质产物的变化都有可能成为疾病的潜在特异性标志物。然而，基因转录水平和翻译水平的表达与蛋白质丰度并不完全一致，基因测序或基因表达定量方面的研究成果并不能预测蛋白质的表达水平及其功能。鉴定细胞内蛋白质的结构、功能以及相互作用是后基因组时代的一项主要目标。阐明患者体液中蛋白质组学的变化，找出特异性的标志物，将有利于疾病的早期诊断及早期治疗。血清、尿液、细胞分泌物等可用于测定蛋白质组成，而且这些样品的取得是无创或微创性的，人们迫切要求直接对这些样品中表达的蛋白质进行分析，找出疾病相关性蛋白质用于疾病的诊断和筛选。 发现、确认并证实疾病相关性蛋白质是既困难又费力的工作，需要对数以千计的蛋白质进行分析。2D-PAGE及相关技术已经证明是蛋白质组学研究的有效工具，然而，它们需要大量时间和劳动，不适合常规临床标本的检测，因而迫切需要高通量、高灵敏度的检测方法用于肿瘤的早期检测。九十年代初出现的表面加强激光解析电离飞行时间质谱(surface-enhanced laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF MS)技术是一种新的方法，适用于发现生物标志物。蛋白质芯片系统(Proteinchip(?) array system)利用SELDI-TOF-MS将蛋白质保留在固相层析第二军医大学硕士论文英文摘要表面，经离子化后用TOF一MS检测。利用这种技术可对血清、尿液、细胞裂解液等生物样品直接进行蛋白一蛋白、蛋白一DNA相互作用的检测。该技术自1993年提出以来发展迅速，目前己经广泛用于寻找疾病标记物的研究。 本研究旨在利用Ciphergen公司的蛋白质芯片飞行时间质谱仪系统，选择弱阳离子芯片，检测原发性肝癌、肝炎肝硬化、慢性乙型肝炎以及健康人血清，得到各自的蛋白质表达谱，分析比较肝癌组与各对照组之间差异表达的蛋白质，以期发现肝癌相关性蛋白质，为寻找肝癌标志物提供新的研究思路。 实验方法 收集59例肝癌、18例肝硬化，21例慢性肝炎，52例健康人血清，分装保存于一80℃冰箱备用。选用Ciphergen公司的wCXZ芯片(弱阳离子芯片)，利用SELDI一TOF技术对样本进行检测，得到其蛋白质质谱扫描谱，进一步采用Ciphergen Biosystems软件3.1.1版本进行波谱分析，寻找肝癌相关性的蛋白质，并与AFP的诊断价值进行比较。 实验结果 实验中共检测到95个有效的蛋白质波峰，其中m/z值在2000一10000Da之lb]的有58个;10000一20000 Da之间的26个;20000一30000 Da之间的11个。在m/z值为66459.21士8.89处检测到一个有效波峰，与白蛋白分子量(66472.21)非常接近，且波峰强度值与血清白蛋白浓度存在正相关。 分析波谱后发现肝癌组与正常对照组有17个波峰的强度值存在明显差异(尸<0.001)，而肝癌组与疾病对照组间共有5个强度值差异明显的波峰。其中m/z值平均为11492.92士7.05的蛋白质仅在肝癌组波峰强度明显升高，各组的中位数波峰强度分别为:肝癌组4.98(5.40);肝硬化组2.02(1.46):肝炎组2.12(1.85);正常对照组1.08(1.10)。 比较该波峰在各组的S/N值发现，52例正常对照及21例肝炎组患者中该波峰的S加值均小于5，在59例肝癌和18例肝硬化患者中，该波峰的S加值大于5的分别为30个和4个。在本组实验中，以该波峰的S/N第3页第二军医大学硕士论文英文摘要值妻5为筛选肝癌的标准，其灵敏度为50.8%，特异度达95.6%;阳性预测值和阴性预测值分别为88.2%，75.0%，且检测结果与AFP的检测结果差别无统计学意义，两者联合后诊断肝癌的灵敏度明显提高，特异度更是达到了100%，而且这种新的诊断方法对肝癌的检测结果与患者的肝功能指标及AFP的升高与否无关。 利用Ciphergen公司的软件对实验所得数据进行分析，我们建立了肝癌与肝硬化、肝癌与慢性肝炎、肝癌与正常对照以及肝癌与非肝癌相鉴别的蛋白质谱型。结果表明，利用波峰谱型诊断肝癌可以提高诊断的灵敏度和特异性。 结论 1、肝癌患者.与肝炎、肝硬化及正常人血清蛋白质组学差异显著。 2、m/z值为11492.92的蛋白质在肝癌患者血清中波峰强度明显升高，可能是肝癌的新的标志物。 3、应用多波峰组成的模型(指纹图谱)对肝癌诊断的价值较单一标志物更大。 4、SELDI一TOF技术是寻找疾病相关性蛋白质的有效工具。 5、利用蛋白质组学技术结合生物信息学分析将有利于建立新的疾病诊断模式一一指纹图谱。