论文部分内容阅读
寻常疣是由人类乳头瘤病毒(HPV)感染引起的皮肤病,具有长期性、复发性等特点。目前临床上采用化学腐蚀剂、广谱抗病毒剂、免疫调节剂、液氮冷冻法、激光法等均存在复发率和毒副作用高的技术难题;中医药通过多靶点、全方位治疗寻常疣,具有高安全性、高治愈率、低复发率、副作用小等特点。双参验方是由临床医师多年治疗寻常疣经验总结得出的搽剂处方,根据企业研究基础、临床数据,该经验方治疗周期短,能减缓患者痛苦,然而搽剂存在使用、保存等问题,受企业委托对处方进行活性成分筛选、精制,并制备外用制剂,为临床治疗寻常疣提供软膏剂。寻常疣的病理现象为表皮棘层细胞受HPV病毒刺激后异常增生导致皮肤出现乳头瘤样突起,人永生化角质形成细胞(HaCaT)用于模拟寻常疣疣体组织中细胞异常增生现象,以双参验方,拆方后丹参、苦参,以及丹参和苦参中主要成分对HaCaT细胞的抑制率为指标,通过CCK-8法考察其对HaCaT细胞增殖的影响并筛选有效活性成分,进一步结合流式细胞术、Hoechst33258DNA染色法、西方印记法探究有效活性成分对HaCaT细胞周期分布、细胞凋亡量和相关蛋白表达的影响,试验结果表明,双参验方和拆方后丹参、苦参均对HaCaT细胞增殖有抑制作用;丹参和苦参中主要成分丹酚酸B、氧化苦参碱在低浓度下就能显著抑制HaCaT细胞增殖;丹酚酸B和氧化苦参碱可以阻滞细胞停留在DNA停止复制的G0/G1期,从而引起细胞早期凋亡;Hoechst33258DNA染色法可直观看到丹酚酸B、氧化苦参碱给药组呈浓度时间效应关系使凋亡细胞呈现出强烈蓝色荧光;西方印记法证明丹酚酸B、氧化苦参碱可能通过显著上调Caspase3、Caspase9、Bax蛋白表达量,下调Bcl-2蛋白表达量,促使增殖的HaCaT细胞凋亡。提示双参验方是通过抑制棘层细胞异常增殖并促进其凋亡,从而使疣体脱落达到治疗目的。通过正交试验考察提取参数及大孔树脂分离参数,以丹酚酸B、氧化苦参碱转移率为提取指标,以成分洗脱率为树脂精制指标,选择丹参总酚酸和苦参总生物碱最佳精制工艺。丹参总酚酸的最佳提取、分离工艺为使用10倍量50%乙醇回流提取丹参药材饮片2次,提取时间1h;药材与AB-8树脂体积比1:2,分别用5倍柱体积的7.5%乙醇和35%乙醇进行除杂和洗脱,流速为4 BV·h-1。苦参总生物碱的最佳提取、分离工艺为苦参药材饮片浸泡0.5h后用十倍量水提取2次,提取时间为2h;药材与AB-8树脂体积比1:2.5,分别用4倍柱体积的6%乙醇和25%乙醇进行除杂和洗脱,流速为2 BV·h-1。所筛选的丹参总酚酸和苦参总生物碱精制工艺符合企业要求,且得到的提取物含量较高,并能够节约成本、方便工业生产。软膏剂研究以丹酚酸B稳定性作为前提,保证制剂的稳定性和均一性,以丹酚酸B含量下降率为指标,从O/W、W/O和油膏三种剂型中筛选出最佳剂型,试验结果表明,最佳剂型为油膏制剂,制备工艺为丹酚酸B和氧化苦参碱提取物冷冻干燥成粉末,9号筛筛成细粉,少量多次加入到110℃熔化的蜂蜡和亚麻籽油混合基质中(药物与基质比例为1:10),并加入2%氮酮,利用高剪切乳化机使其分散均匀、冷却至室温制成油膏制剂。双参验方抗寻常疣油膏为浅棕色、质地细腻、易涂布,稳定性良好的半固体制剂。制剂中丹酚酸B和氧化苦参碱体外透皮吸收与时间呈线性关系,透皮效果良好。