蛋白质糖基化是蛋白翻译后的主要修饰过程,近来,在工业应用中利用大肠杆菌生产重组蛋白,以获得糖基化治疗性蛋白的进程,已有稳步发展。细菌多糖蛋白质缀合物的传统生产方式是化学法,多糖和蛋白质的连接主要采用化学反应进行,使用化学方法把糖链添加到载体蛋白上具有生产过程步骤繁多,生产成本高,糖基化位置不确定和糖链数目难以控制等弊端。生物法合成可以明显地避免这些弊端。最近,在细菌中发现了一种细胞质可溶性N-糖基转移酶(N-glycosyltransferase,NGT),它以活化的糖-核苷酸作为供体底物,将已糖转移至蛋白质或多肽序列(N-(X(?)P)-S/T)的天冬酰胺(Asn)侧链上。目前发现的NGT类酶数量有限,还未见到NGT介导的糖蛋白缀合物疫苗的报道。基于NGT的巨大应用价值,理解NGT酶学性质对糖生物学领域具有重要意义。我们选用肺炎链球菌疫苗中常出现的肺炎链球菌3型,在了解NGT酶学性质的基础上,建立合酶依赖细菌多糖蛋白质疫苗生产平台,提供一种新的糖蛋白缀合物疫苗合成生产方法。拓展酶法合成合酶依赖型细菌多糖蛋白质缀合物疫苗的应用范围。我们需要鉴定更多具有底物特异性的不同来源NGT同种型,并对其酶学性质进行了探究。表达并纯化了来自不同细菌的四种N-糖基转移酶,ApNGT(来自Actinobacilluspleuropneumoniae),AaNGT(来自Aggregatibacter aphrophilus),KkNGT(来自Kingella kingae和BtNGT(来自Bibersteinia trehalosi),通过体外糖基化分析并比较了它们对四种合成肽的催化活性,其显示出不同的底物选择性:相比其他三种NGT,ApNGT对长肽底物较高的偏好性;AaNGT对六肽DANYTK糖基化效率最高;KkNGT与BtNGT对底物选择上受肽糖基化位点周围氨基酸的不同而有差异。分析各种NGT同种型之间的肽底物特异性,可以拓宽NGT催化各种治疗性蛋白质的N-糖基化应用。NGT能够成功识别简单肽底物基础上,接下来探究NGT对复杂蛋白的识别,生物法实现了NGT对载体蛋白的糖基化修饰。基于第一部分的实验结果,NGT同种型之间的肽底物偏好性不同,确定了一种对底物蛋白识别的NGT,并对底物蛋白序列改造实现了 NGT对底物蛋白的识别,通过利用NGT与载体蛋白在大肠杆菌中共表达,实现了NGT对载体蛋白的糖基化修饰。建立肺炎链球菌3型多糖蛋白质疫苗平台。我们获得了肺炎链球菌3型合成酶Cps3s基因。我们在上一步的基础上完成NGT介导的载体蛋白糖基化修饰,糖基化的载体蛋白为糖基受体,糖基供体为UDP-Glc,UDP-GlcUA,进一步利用Cps3S合成酶体外糖基化反应生产肺炎链球菌3型多糖蛋白缀合物。由于Cps3S合成酶是跨膜蛋白,利用大肠杆菌异源表达纯化Cps3S合成酶未得到理想结果。