心脏缺血性疾病具有很高的发病率和死亡率,是目前工业化社会人类死亡的首要原因。在全世界范围内,每年都有数万人发生心肌梗死,导致大量心肌细胞死亡,由于心肌细胞再生能力有限,尽管有良好的药物治疗,但仍会继发心力衰竭。目前治疗终末期心力衰竭患者的主要方法是植入左室辅助装置(Left Ventricular Assist Devices,VAD)或心脏移植。VAD主要用于预防左室重塑和扩张,并不能从根本上改善心脏的收缩功能。而心脏移植却受到移植器官来源有限及移植后引发免疫排斥反应等因素的限制。心肌组织工程是一门正在迅速发展的新兴学科,它在体外将细胞与支架材料结合从而制造工程化心肌组织用于修复或再生受损心肌,为治疗心脏缺血性疾病带来了新的希望。但是,心肌细胞来源有限以及体内移植后大量细胞或组织死亡,阻碍了这种策略的实际应用。胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESC)具有多能性,可在体外无限增殖,又能分化为心肌细胞,是目前用于构建工程化心肌组织最有前途的细胞来源之一。ESC应用于临床的最大障碍之一就是其致瘤性。不仅是ESC的移植会导致肿瘤的生成,ESC来源的分化细胞移植也可能会有肿瘤形成的风险。尽管报道了多种可使ESC分化为心肌细胞的方法,但ESC分化来的细胞中仍然含有大量的非心肌细胞及部分未分化的ESC。如何有效地获取ESC来源的心肌细胞并去除未分化的ESC,是应用ESC来源的心肌细胞构建工程化心肌组织有待解决的难题。此外,体外构建的工程化心肌组织由于缺乏血管网络,其大小受到了限制。大部分的心肌移植物都依赖于宿主发生血管化,对于更厚的组织来说,宿主自身的血管要经过很长一段时间才能生长到移植物内部,在这段时间内由于不能提供移植物充足的毛细血管网,移植物中的细胞由于缺乏营养而发生凋亡或坏死,进而影响心肌移植物发挥功能。针对心肌组织工程所面临的上述问题,本研究采用基因修饰的手段赋予小鼠ESC及其衍生的心肌细胞特异性筛选标记,使之易于纯化ESC来源的心肌细胞以及有效去除未分化的ESC,在此基础上,以液态胶原为支架体外构建高度血管化的心肌组织,探索基因修饰的ESC作为种子细胞构建血管化心肌组织的可行性,相关研究国内外尚未见报道。我们以小鼠基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到心肌α-MHC启动子,将心肌α-MHC启动子置换pcDNA3.1(+)-EGFP-hygro载体中的CMV启动子,成功构建出α-MHC-EGFP表达载体。通过电穿孔法将α-MHC-EGFP转染原代小鼠心脏细胞72 h后,在荧光显微镜下可见转染阳性的心肌细胞发出绿色荧光,而非心肌细胞没有出现绿色荧光,证明我们构建的α-MHC-EGFP表达载体具有心肌特异性表达特性。为了更容易地选择ESC来源的心肌细胞,我们将EGFP筛选标志替换为新霉素抗性基因,成功获得心肌特异性表达载体pMHC-neo/SV40-hygro。将pMHC-neo/SV40-hygro载体转染到小鼠ESC中,成功获得了6株基因修饰小鼠ESC细胞系,其中一株ESC细胞系命名为MN6,不仅能稳定表达转基因,而且增殖迅速且保持未分化状态。转基因pMHC-neo/SV40-hygro的表达不影响ESC向心肌细胞分化,它们具有与野生型ESC相似的发育模式,能够分化出自发跳动的心肌细胞。ESC分化培养物中的跳动区域呈肌钙蛋白T染色阳性,并具有很好的空间相关性。基因修饰的ESC悬浮培养5天形成拟胚体(Embryoid Body,EB),再经抗坏血酸诱导12天后,加入G418筛选6天,选择后的细胞99%以上表达心肌特异性标志α-肌小节肌动蛋白。RT-PCR结果显示,G418选择后的细胞中未检测到Oct-4的表达,表明可能没有未分化的ESC。激光扫描共聚焦显微镜观察和超微结构分析显示,G418选择后的心肌细胞能够表达心肌特异性标志,并具有发育良好的肌原纤维。对于潜在的实际应用来说,需要建立一种可控的大规模生产ESC来源的心肌细胞的方法。我们尝试采用搅拌式生物反应器培养基因修饰小鼠ESC,通过摸索基因修饰小鼠ESC不同接种密度及生物反应器初始搅拌速度对EB形成的影响,以细菌培养皿常规静态培养的EB为对照,用抗坏血酸诱导其向心肌细胞分化,比较两种培养体系对ESC向心肌细胞分化潜能的影响。与细菌培养皿相比,搅拌式生物反应器能有效控制EB之间发生广泛凝聚,EB形成的效率更高。当ESC的接种密度为2×105个/ml,搅拌速度设定为25 rpm时,通过体外培养5天,搅拌式生物反应器中可形成EB约482个/ml,EB大小相对均一,直径为496±20 m。AO/PI和H&E染色结果显示,搅拌式生物反应器培养的EB中细胞活力更好,没有出现中心坏死。搅拌式生物反应器培养EB的心肌特异性基因的表达水平明显增加,贴壁诱导分化培养后,EB能迅速贴壁生长出分化细胞,不仅出现跳动心肌细胞的EB数的百分比更高,而且EB分化细胞中α-肌小节辅肌动蛋白阳性的细胞百分比也更高。此外,搅拌式生物反应器培养的EB在G418选择后获得的心肌细胞相对产量也更高。内皮毛细血管不仅可为心肌移植物提供氧气和营养,而且内皮与心肌细胞之间的相互作用对细胞的存活和增殖具有重要作用。我们以基因修饰的小鼠ESC作为种子细胞,在搅拌式生物反应器中大规模制备EB,采用抗坏血酸诱导其向心肌细胞分化,通过G418筛选ESC来源的心肌细胞,将富集的心肌细胞与人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)和胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblasts,MEF)混合,以鼠尾液态胶原为支架在体外构建高度血管化的心肌组织,并进行初步的体内移植研究。血管化心肌组织中的细胞不仅排列致密均匀,而且凋亡细胞明显减少,更类似于新生小鼠心肌的结构特征。血管化心肌组织移植裸鼠皮下后四周,所有标本均未观察到肿瘤的形成,移植物中的细胞能够存活。重要的是,HUVEC能促进工程化心肌组织的血管化,而添加的MEF能进一步支持内皮细胞组装到血管网络中,使管腔的数量和面积有明显的提高,因而能形成更厚的心肌组织。研究结果表明,基因修饰的小鼠ESC能够作为构建工程化心肌组织的种子细胞来源,采用基因修饰的手段既能便于ESC来源的心肌细胞的纯化,又能有效控制未分化ESC的潜在风险。基因修饰的ESC来源的心肌细胞与HUVEC和MEF混合后,以液态胶原为支架进行三维培养可以形成高度血管化的心肌组织。