研究目的与意义学习记忆是大脑的高级功能之一,在我们生存和生活过程中发挥着重要作用。认清学习记忆发生的本质,不仅可以帮助我们更好的认识及改造世界,也能为临床上以学习记忆能力异常为主要特征的某些神经精神疾病,如阿尔兹海默氏病、创伤后应激障碍(PTSD)、成瘾等的治疗,提供有效的治疗靶点和治疗方案。基因转录及蛋白质合成的动态变化以及由其导致的神经元结构及功能的可塑性,在形成记忆的过程中发挥着非常重要的作用。目前已知,特定神经环路中的特定神经元内一系列关键分子及其下游信号通路的激活,是上述过程的前提,但是由于这些关键分子的变化时间有限(从几小时至几天,最长不过几个月),并不能维持基因转录及蛋白合成的长期变化,提示我们学习记忆的形成及保存还需另外的机制参与。近期研究发现,表观遗传(epigenetic)修饰对基因转录的持续调控,在长期记忆的过程中发挥重要作用。表观遗传修饰即在保持核苷酸序列不变的情况下,通过改变染色质的空间构型、调节转录因子与相关基因的结合,来影响基因的表达,主要包括组蛋白的修饰(包括乙酰化、甲基化、磷酸化等)、DMA甲基化修饰、染色质重塑和非编码RNA等作用方式。其中乙酰化修饰备受关注,发现其动力学变化在多种认知过程以及神经精神疾病中发挥重要作用。乙酰化可发生于每一个组蛋白的多个位点上,严格受到两种作用完全相反的酶,组蛋白乙酰化转移酶(histone acetyltransferase,HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)的动态调控。HAT激活后将乙酰辅酶A的乙酰基转移到组蛋白氨基末端特定的赖氨酸残基上,主要使DNA与组蛋白的亲和力降低,有利于各种转录因子连同协同转录因子与DNA相应位点特异性结合,激活特定基因的转录,促进大脑的认知能力。而HDAC则促进组蛋白去乙酰化,从而促进组蛋白与DNA紧密结合,染色质更加致密卷曲,基因的转录因此受到抑制,从而在多个脑区中对学习记忆能力进行负调节。目前研究表明HDAC在学习记忆中发挥重要作用,机体内有HDAC共4类,18种(HDAC1-11和SIRT1-7),不同的HDAC在学习和记忆中发挥不同的作用。有研究表明敲除小鼠海马CA1区HDAC3,可以增强方位认知能力但是不影响新奇物体认知能力;HDAC5敲除小鼠表现出空间记忆能力缺失,但不影响联想学习记忆的形成;过表达HDAC1可以促进恐惧记忆的消退,但不影响恐惧记忆的形成。使用HDAC的抑制剂可以有效增强动物在条件性恐惧记忆、物体方位认知,新奇物体认知,食物偏好及空间记忆测试中的表现,提示抑制HDAC的活性可以增强学习记忆能力,并有望成为改善人类记忆缺陷的新方法。但目前使用的HDAC抑制剂具有广谱性,而通过作用于何种特异性的HDAC发挥改善记忆的作用仍不清楚,这极大限制了选择性HDAC抑制剂的开发和应用。因此进一步阐明不同HDAC在学习和记忆中的作用及机制,将为开发特异性HDAC抑制剂提供重要的理论依据。环境依赖性恐惧记忆(contextual fear conditioning,CFC)是一种经典的学习记忆模型,可以分别检测学习记忆的获得,短时记忆和长时记忆的形成。对CFC训练后海马CA1脑区进行基因芯片的筛选发现,包含HDAC7在内的多种HDACs发生了明显的变化,提示HDAC可能在其中发挥重要作用。HDAC7是Ⅱ类HDAC,研究多集中于心血管及免疫等非神经系统,但其在学习记忆中的作用及机制尚未见报道。为此,本课题应用CFC模型及体内外实验研究HDAC7在学习和记忆中的作用及其机制。研究表明在CFC后小鼠背侧海马(dorsal hippocampus,DH)脑区中HDAC7表达明显下降;过表达或者干扰HDAC7可以明显改变小鼠CFC学习记忆的能力,提示HDAC7在学习记忆中发挥重要作用。进一步通过蛋白质谱筛选、免疫共沉淀及体内外泛素化实验研究表明CFC记忆形成过程中E3连接酶CBX4参与了 HDAC7的降解,并发现HDAC7通过调控下游效应分子Nur77参与到环境依赖恐惧记忆的调控,本课题充实和完善了对HDAC7在学习记忆中生物学功能的认识,为临床相关疾病治疗提供新的靶点和思路,具有重要的理论意义和潜在的应用价值。研究方法1.HDAC7在环境依赖恐惧记忆形成过程中的生理学变化1.1 环境依赖恐惧记忆模型的构建及HDAC7的检测选取年龄为12周的雄性野生型(wildtype,WT)C57BL/6J小鼠。单只分笼放在环境依赖恐惧记忆模型(contextual fear conditioning,CFC)训练房间适应一晚上,然后进行实验。将小鼠柔和的放入CFC训练箱内,使其自由活动适应箱内环境2min,然后分别给予三次足底电击(0.4 mA或0.7 mA)2s,每两次足底电击之间的间隔为58s。最后一次足底电击后,小鼠在训练箱中再放置58s,然后放回饲养笼中,继续单只饲养。整个训练过程一共持续5min。在实验所需的时间点处死小鼠,断头取材。使用蛋白质免疫印迹法(western blot,WB)、Real-time RT-PCR 和免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)检测 HDAC7 通过 CFC 训练后在背侧海马(dorsal hippocampus,DH)脑区中表达变化。1.2 HDAC7变化的特异性CFC模型建立成功后6h处死小鼠,断头取脑。用脑模具将小鼠的背侧海马(dorsal hippocampus,DH)、腹侧海马(ventral hippocampus,VH)和基底外侧杏仁核(basolateral amygdale,AMY)分别取出,使用蛋白质免疫印迹法(western blot,WB)检测HDAC7蛋白水平在不同脑区的变化,以及在背侧海马(dorsal hippocampus,DH)脑区,不同HDACs的蛋白水平的变化。1.3 环境及恐惧记忆的偶联引起HDAC7的生理学变化单笼饲养的小鼠,分别进行CFC训练,足底电击单因素刺激(shock,只用电击板快速给予小鼠足底电击)和环境单因素刺激(context,把小鼠放入CFC训练箱内5min,不给予足底电击)。训练后6h处死小鼠,断头取脑,使用蛋白质免疫印迹法(western blot,WB)检测HDAC7蛋白水平在不同刺激中的变化。2.HDAC7在小鼠环境依赖恐惧记忆形成过程中的作用2.1 病毒的构建及效率检测用四质粒系统转染293T细胞进行病毒包装及生成,转染72h后收集病毒液进行纯化浓缩。将浓缩的病毒液用脑立体定位仪和微量注射泵定点注射到小鼠的DH脑区。然后用组织免疫荧光(immunofluorescence,IF)方法检测病毒的侵染效率,用WB检测HDAC7的干扰和过表达效率。2.2 干扰或过表达HDAC7对小鼠环境依赖恐惧记忆的影响用病毒在小鼠DH脑区干扰或者过表达HDAC7,然后进行CFC训练。分别在训练后1h和24h进行CFC测试,将经过CFC训练的小鼠放回训练箱5min,不给足底电击,记录小鼠的不动(freezing)时间。检测小鼠的短时记忆(short term memory,STM)和长时记忆(long term memory,LTM)。2.3 HDAC7作用的特异性用病毒在小鼠AMY脑区干扰或者过表达HDAC7,然后进行CFC训练。分别在训练后1h和24h进行CFC测试,将经过CFC训练的小鼠放回训练箱5min,不给足底电击,记录小鼠的不动(freezing)时间。检测小鼠的短时记忆(short term memory,STM)和长时记忆(long term memory,LTM)。3.HDAC7在不同海马依赖的学习记忆模式中的作用用病毒装载干扰或者过表达HDAC7的质粒,在小鼠DH脑区干扰或者过表达HDAC7。用水迷宫检测HDAC7对空间记忆的影响,采用一个直径为120cm,高度40cm的圆柱形水池。水温恒定在22℃C,在水池周围布置不同的装饰物作为观察标记。将水池平分为四个象限,在其中一个象限中央放置一个隐藏的平台。将小鼠面向池壁放入水中,使其自由游泳寻找平台,连续训练5天,第6天进行测试。用Smart软件记录小鼠的轨迹和找到平台的潜伏期。检测小鼠的空间学习记忆能力。用方位认知模型检测HDAC7对小鼠方位认知的影响。在长*宽*高为40cm*40cm*35cm的立方体空间内,放入两个相同的物体,让小鼠进行自由探索训练,24h后移动其中一个物体的位置,让经过探索训练的小鼠再次自由探索。用Smart软件记录小鼠的轨迹和对不同位置物体的探索时间。检测小鼠的方位认知能力。4.HDAC7生理变化的机制4.1 HDAC7蛋白合成和降解的检测将小鼠进行埋管手术,恢复两周后进行CFC训练。CFC训练前分别将溶剂对照,蛋白合成抑制剂CHX和蛋白降解抑制剂βLAC通过微管注射到小鼠DH脑区。然后进行CFC训练,训练后6h处死小鼠,断头取材。用WB的方法检测HDAC7蛋白水平的变化。用Co-IP的方法检测HDAC7的泛素化的变化。4.2 HDAC7的E3连接酶的筛选及验证用蛋白质谱筛选HDAC7的E3连接酶。用外源Co-IP,内源Co-IP,纯化蛋白直接结合以及体外泛素化的方法验证HDAC7的E3连接酶。4.3 E3连接酶对HDAC7参与环境依赖恐惧记忆的影响用病毒装载CBX4的干扰序列。采用定点注射的方法,用立体定位仪和微量注射泵在小鼠DH脑区注射病毒。然后将小鼠进行CFC训练及测试。记录小鼠的freezing值。5.HDAC7影响环境依赖恐惧记忆的机制5.1 HDAC7调控的组蛋白乙酰化位点的筛选用病毒干扰小鼠DH脑区中的HDAC7,然后进行CFC训练。6h后处死小鼠,断头取材,用WB的方法检测不同乙酰化位点的变化。5.2 HDAC7调控的下游靶基因及其调控机制将小鼠进行CFC训练,在不同时间点取材。用Real-time RT-PCR方法检测Nur77的变化。在体外神经元和小鼠DH脑区中分别用病毒干扰或者过表达HDAC7,然后用WB的方法检测Nur77的变化。用染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay,CHIP)的方法检测 HDAC7 对 Nur77 promoter的影响。5.3 HDAC7下游靶基因对环境依赖恐惧记忆的影响用病毒装载Nur77的干扰序列。在小鼠DH脑区定点注射干扰Nur77的病毒。然后进行CFC训练及测试,记录小鼠的freezing值。研究结果1.HDAC7在环境依赖恐惧记忆形成过程中的表达变化1.1 HDAC7在环境依赖恐惧记忆形成过程中蛋白水平明显降低WB检测小鼠DH脑区HDAC7的表达。结果显示,在CFC训练4h后HDAC7蛋白水平与正常对照(naive)组比较有显著降低,到6h后降到最低,并能持续到24h。这一结果在IHC结果中也得到了验证。1.2 HDAC7蛋白水平在背侧海马脑区特异性的降低WB检测小鼠不同脑区中HDAC7在CFC训练后蛋白水平的变化。结果显示,与对照组相比,只有DH脑区中HDAC7蛋白水平降低,VH和AMY脑区中HDAC7的蛋白水平没有明显变化。WB检测不同HDACs在CFC训练后的变化,结果发现,与对naive相比,HDAC7蛋白水平明显降低。1.3 环境及恐惧记忆的偶联促进HDAC7的变化WB检测不同刺激对HDAC7蛋白水平的影响。结果显示,与naive组相比,单因素刺激(context,shock)组HDAC7没明显变化,CFC训练组HDAC7蛋白水平明显降低。2.背侧海马内HDAC7损伤环境依赖恐惧记忆形成2.1 背侧海马内HDAC7可以调控环境依赖恐惧记忆形成用病毒分别装载HDAC7过表达质粒和干扰质粒以及相应的对照质粒,在小鼠DH脑区定点注射,然后进行CFC训练和测试,记录小鼠的Freezing值。结果显示,与对照病毒组比较,过表达或干扰HDAC7组的小鼠在训练和STM测试的Freezing值均没有显著变化,但是在LTM测试中,过表达HDAC7小鼠的Freezing值较对照组有显著的下降。而干扰HDAC7小鼠的Freezing值较对照组有显著的升高。2.2 在杏仁核脑区HDAC7不影响环境依赖恐惧记忆形成用病毒分别装载HDAC7过表达质粒和干扰质粒以及相应的对照质粒,在小鼠AMY脑区定点注射,然后进行CFC训练和测试,记录小鼠的Freezing值。结果显示,与对照病毒组比较,干扰HDAC7或者过表达HDAC7组的小鼠在训练、STM和LTM测试中的Freezing值均没有显著变化。3.HDAC7参与多种海马依赖的学习记忆范式3.1 干扰HDAC7促进小鼠空间记忆及方位认知能力在小鼠DH脑区干扰HDAC7,然后进行水迷宫训练及测试。结果发现,干扰HDAC7组的小鼠与对照组相比,找到平台的潜伏期明显降低;进行方位认知训练及测试。结果发现,干扰HDAC7组的小鼠与对照组相比,探索新位置物体的时间明显增加。3.2 过表达HDAC7损伤小鼠空间记忆及方位认知能力在小鼠DH脑区过表达HDAC7,然后进行水迷宫训练及测试。结果发现,过表达HDAC7组的小鼠与对照组相比,找到平台的潜伏期明显增加;进行方位认知训练及测试。结果发现,过表达HDAC7组的小鼠与对照组相比,探索新位置物体的时间明显减少。4.HDAC7在环境依赖恐惧记忆形成过程中通过泛素化降解4.1 HDAC7在环境依赖恐惧记忆形成过程中泛素化增加Real-time RT-PCR检测CFC对DH脑区中HDAC7的mRNA水平的影响并发现,与naive组相比,CFC后各个时间点小鼠DH脑区中HDAC7的mRNA水平没有明显改变。用内源Co-IP检测CFC后HDAC7的泛素化的变化。结果发现,CFC组较对照组泛素化水平明显增加。用脑内埋管技术,在小鼠DH脑区中微量注射蛋白合成抑制剂CHX,蛋白降解抑制剂βLAC和溶剂对照,然后进行CFC训练。用WB检测HDAC7蛋白水平,结果发现,βLAC组HDAC7与对照组相比没有明显差异,CHX组HDAC7蛋白水平较对照组明显降低。4.2 CBX4作为HDAC7的E3连接酶促进HDAC7的泛素化降解用质谱的方法筛选HDAC7的E3连接酶,结果发现CBX4是HDAC7紧密结合的E3连接酶。用内源Co-IP,外源Co-IP以及体外纯化蛋白Co-IP检测HDAC7和CBX4的结合。结果发现,HDAC7和CBX4有明显的结合。用内源Co-IP及体外泛素化实验检测CBX4对HDAC7泛素化的影响,结果发现,干扰CBX4组HDAC7泛素化较正常组明显减少。4.3 CBX4在环境依赖恐惧记忆形成过程表达增加用WB检测CBX4在CFC过程中的变化。结果发现,与naive相比,CBX4在CFC后表达明显增加。用WB检测干扰CBX4后HDAC7的表达变化,结果发现,干扰CBX4组与对照组相比HDAC7的表达明显增加。4.4 干扰CBX4可以损伤环境依赖恐惧记忆形成用病毒装载CBX4的干扰质粒,定点注射在小鼠DH脑区,然后进行CFC训练,记录小鼠freezing值。结果发现,干扰CBX4组小鼠的freezing值较对照组明显降低。并且同时干扰Nur77和HDAC7组小鼠的Freezing值较单独干扰CBX4组有显著升高。5.HDAC7通过Nur77发挥调控环境依赖恐惧记忆的形成5.1 Nur77在环境依赖恐惧记忆形成过程表达增加用Real-time RT-PCR和WB检测CFC后Nur77的表达变化,结果发现,与naiive组相比,CFC训练能促进DH脑区中Nur77的表达,但是VH脑区中Nur77没有明显变化。5.2 HDAC7通过抑制H4K12位点的乙酰化调控Nur77的表达用WB和CHIP的方法检测HDAC7对Nur77的调控机制。结果发现,与对照组相比,干扰HDAC7组H4K12位点的乙酰化水平明显增加,Nur77 promoter表达显著升高,Nur77蛋白水平较对照组有明显的升高。5.3 干扰Nur77损伤环境依赖恐惧记忆形成,并且能一定程度的逆转HDAC7的作用用病毒装载Nur77的干扰质粒,在小鼠DH脑区定点注射病毒干扰Nur77表达,然后进行CFC训练及测试,记录小鼠Freezing值。结果发现和对照组相比较,单独干扰Nur77组小鼠的Freezing值明显降低,并且同时干扰Nur77和HDAC7组小鼠的Freezing较对照组也明显降低。研究结论与创新性1.本研究首次阐明了 HDAC7在海马依赖的学习记忆中的表达变化及其调控机制,发现在CFC联想学习记忆过程中HDAC7表达明显降低,过表达HDAC7损伤海马依赖的学习记忆,CFC记忆形成过程中E3连接酶CBX4参与了HDAC7的降解。2.本研究进一步阐明HDAC7调控海马依赖学习记忆的作用机制,发现HDAC7通过调控H4K12位点乙酰化调控下游基因Nur77的表达,从而影响海马依赖的学习记忆。综上,本研究发现HDAC7通路调控海马依赖学习记忆的多个靶点,包括:CBX4,HDAC7和Nur77,为治疗临床上以学习记忆能力异常为主要特征的疾病提供了重要的实验基础和理论依据。