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尾加压素Ⅱ(urotensinⅡ,UⅡ)最初是从鱼尾部垂体分离出来的神经肽,为迄今所知缩血管作用最强的活性物质。研究发现UⅡ可能具有心血管和中枢神经调节作用,并提示UⅡ的心血管作用可能与NO有关。目前,研究已证实UⅡ的特异性受体为孤儿G蛋白偶联受体GPR14。但有关GPR14在大鼠心血管和脑组织的表达和分布以及UⅡ对心肌细胞的作用及其机制尚有争议。为进一步阐明UⅡ的心血管作用及其机制以及UⅡ受体GPR14在心血管和脑组织的表达与分布,本研究采用半定量逆转录-聚合酶链反应和原位杂交组织化学等技术,考察了受体GPR14在大鼠心血管组织及心肌细胞内的表达和分布;应用离体灌流大鼠心脏模型及蛋白印迹杂交等技术,观察了大鼠UⅡ对心脏的作用,初步探讨了其与NOS/NO合成系统的关系及机制;采用Bradford法和MTT法检测了UⅡ对心肌细胞总蛋白合成和细胞活力的影响,分析UⅡ诱导心肌细胞肥大作用,观察了UⅡ对心肌细胞NOS/NO合成系统的影响,初步探讨了UⅡ诱导心肌细胞肥大作用与NOS/NO合成系统的关系及可能机制;此外,还观察了受体GPR14在大鼠中枢神经系统内的表达和分布。本研究主要结果如下。一、UⅡ受体GPR14 mRNA在大鼠心血管及心肌细胞的表达与分布1. GPR14 mRNA在大鼠左心室、左心房、胸主动脉、颈总动脉等心血管组织有表达,其中左心室表达丰度最高。2.GPR14 mRNA分布于大鼠心肌组织,阳性杂交信号主要位于心肌细胞胞浆。3.原代培养的新生大鼠心肌细胞能表达GPR14 mRNA,阳性杂交信号主要分布于心肌细胞和成纤维细胞的胞浆。二、大鼠UⅡ对离体灌流大鼠心脏的作用及其机制1.分别给予离体灌流大鼠心脏6.66(10-5 、6.66(10-4、6.66(10-3、6.66(10-2和0.67μg的UⅡ5min后,冠脉流量由对照组的9.22±0.80分别增加至9.95±0.37、9.98±0.51、10.13±0.68、10.28±0.43和10.49±0.56 ml/min·g-1protein,呈剂量依赖性;给予6.66(10-2μg UⅡ,5min后冠脉流量最大,然后缓慢下降,但仍高于对照组;5、10、15、20、25和30min后,冠脉流量分别增加至10.28±0.43、9.71±0.30、9.60±0.47、9.48±0.56、9.29±0.46和9.27±0.77ml/min·g-1protein,<WP=6>呈时间依赖性。UⅡ能轻度增加灌流心脏的心率、LVSP和+dP/dtmax(P>0.05),而LVDEP和-dP/dtmax则无显著性变化。2. 单独给予NOS抑制剂L-NAME 30.6μg后,冠脉流量为7.90±0.84 ml/min·g-1protein;心率为193±19次/min;LVSP为9.19±0.78 kPa;+dP/dtmax为336±12kPa/s;L-NAME预处理20min后再给予UⅡ,冠脉流量、心率、LVSP和+dP/dtmax分别为8.65±0.56ml/min·g-1protein、201±11次/min、9.19±0.78kPa和344±26kPa/s,LVDEP和-dP/dtmax与UⅡ剂量为6.66(10-2μg组相比无显著性变化;NO供体SNP 3.38(103μg预处理20min后再给予UⅡ,冠脉流量、心率、LVSP、LVDEP和±dP/dtmax均无显著性变化。3. 单独给予PKC激动剂PMA 0.70μg,心率为240±22次/min;PAM预处理20min后再给予UⅡ,心率增加至259±21次/min,而冠脉流量、LVSP、LVDEP和±dP/dtmax与UⅡ剂量为6.66(10-2μg组相比均无显著性变化。单独给予PKC抑制剂Stau 5.29(10-5μg,冠脉流量、LVSP和+dP/dtmax分别为7.90±0.43ml/min·g-1protein、10.21±0.84kPa和332±25kPa/s;Stau 5.29(10-5μg预处理20min后再给予UⅡ,冠脉流量、LVSP和+dP/dtmax分别为9.10±0.72 ml/min·g-1protein、10.45±0.94 kPa 和328±23 kPa/s,而心率、LVDEP和-dP/dtmax无显著性变化。4.分别给予离体灌流大鼠心脏6.66(10-5 、6.66(10-4、6.66(10-3、6.66(10-2和0.67μg的UⅡ,心肌组织NOS活性由对照组的4.00±0.10分别增加为4.35±0.16、4.53±0.13、5.12±0.11、4.68±0.11和4.75±0.12nmol/min·mg-1protein。给予6.66(10-2μg 的UⅡ 5、10、15、30和45min后,NOS活性分别增加至4.78±0.13、5.15±0.20、5.34±0.12、4.85±0.16和4.54±0.12nmol/min·mg-1protein。L-NAME 30.6μg或Stau 5.29(10-5μg预处理20min再给予UⅡ,与UⅡ剂量为6.66(10-2μg组相比, 30min后NOS活性分别显著降低3.28±0.19和3.56±0.16 nmol/min·mg-1protein;而SNP或PMA预处理后,NOS活性则均无显著性变化。5.分别给予离体灌流大鼠心脏6.66(10-5 、6.66(10-4、6.66(10-3、6.66(10-2和0.67μg的UⅡ30min,心肌eNOS含量分别增加(26.2±2.3)%、(55.8±4.8)%、(82.5±7.4)%、(96.2±7.8)%和(68.2±5.5)%;给予6.66(10-2μg 的UⅡ15、30和45min后,心肌eNOS含量分别增加(126.9±11.1)%、(96.2±7.8)%和<WP=7>(30.4±2.6)%。与UⅡ剂量为6.66(10-2μg组相比,30.6μg L-NAME或5.29(10-5μg Stau预处理20min后再给予UⅡ,eNOS含量分别下降至(39.4±3.5)%和(66.1±5.2)%;而SNP或PMA预处理后则对eNOS含量均无显著性变化。三、大鼠UⅡ对新生大鼠心肌细胞的促肥大作用及其机制1.给予UⅡ10-7mol/L直至5d后,细胞总蛋白质含量才由对照的130±15μg/ml显著增加至161±14μg/ml;分别给予10-10、10-9、10-8、10-7和10-6mol/L的UⅡ,光吸收度值可显示细胞线粒体内琥珀酸脱氢酶的活性从而反映