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目的:构建靶向人PIK3CA(P110α)基因的RNAi慢病毒载体,体外转染人卵巢上皮性癌细胞株SKOV3。应用Real-time PCR检测PIK3CA基因沉默效果;MTT检测感染慢病毒后SKOV3细胞增殖能力的改变,流式细胞术检测慢病毒感染细胞后细胞凋亡和细胞周期的变化。初步探讨慢病毒介导RNAi沉默PIK3CA基因在卵巢癌基因治疗中的应用前景,以开辟治疗卵巢癌的新途径。方法:1首先进行PIK3CA基因RNAi靶点设计:根据基本设计原则再结合RNAi效率预测公式,筛选出4条理论上最佳的siRNA序列,同时选择一个阴性对照靶点。将设计好的siRNA序列编码成shRNA框架,化学合成5个靶点的DNA片段。2 Hpa I和Xho I酶切pGCL-GFP载体以使其线性化。3将合成的DNA双链直接连入酶切后的pGCL-GFP载体。连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞,PCR鉴定阳性克隆后送测序。4从大肠杆菌中提取阳性克隆pGCL-GFP-PIK3CA。5 XhoⅠ和SacⅡ酶切真核表达载体pEGFP-C1使其线性化。通过PCR从含有PIK3CA片段的质粒克隆模板中提取PIK3CA片段,并用XhoⅠ和SacⅡ对其进行酶切。6将PIK3CA片段酶切产物与酶切后的真核表达载体pEGFP-C1连接,PCR鉴定阳性克隆并送测序。7将融合蛋白pEGFP-C1-PIK3CA用Lipofectamine 2000转染293T细胞,36-48 h后在荧光显微镜下通过观察融合蛋白GFP/RFP的表达情况,显示PIK3CA基因是否正确表达。8将敲减质粒pGCL-GFP-PIK3CA和表达质粒pEGFP- C1-PIK3CA以不同比例共转染293T细胞,通过Western Blot检测PIK3CA基因的表达水平,筛选出RNA干扰的最有效靶点。9分别提取重组慢病毒载体pGCL-GFP-PIK3CA、包装质粒pHelper 1.0(gag/pol元件)载体和Helper 2.0(VSVG元件)载体三质粒,用Lipofectamine 2000转染293T细胞,培养48 h后收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,对其进行浓缩,得到高滴度的慢病毒浓缩液,在293T细胞中应用逐孔稀释滴度测定法测定病毒滴度,4 d后观察荧光表达情况,得到病毒原液的滴度值。10将病毒原液感染生长状态良好的SKOV3细胞,每组5个复孔,感染3 d后在荧光显微镜下观察GFP表达情况。感染5 d后收集细胞,采用Real-time PCR方法检测PIK3CA基因mRNA表达情况。11将CON组(未加病毒组)、NC组(加RNAi病毒组)、KD组(加阴性对照病毒组)三组细胞分别接种于96孔板,每种细胞5个复孔,MTT检测其第1、2、3 d自然生长情况。12将CON组、NC组、KD组三组细胞分别接种于6孔板,5 d后收集细胞用流式细胞仪进行细胞凋亡和细胞周期检测。结果:1针对PIK3CA设计了4个RNAi靶点,选择了一个阴性对照靶点,并构建了病毒载体框架,退火形成双链DNA oligo,经12%非变性PAGE凝胶电泳检测双链退火正确。2 Hpa I和Xho I酶切pGCL-GFP载体以使其线性化,琼脂糖凝胶电泳结果显示酶切成功。3 siRNA直接连入酶切成功后的pGCL-GFP载体,连接产物转入制备好的大肠杆菌感受态细胞,PCR鉴定了克隆转化结果,并挑选出阳性克隆psc1-1、psc2-1、psc3-1、psc4-1、pscNC-1菌液送Invitrogen公司进行ABI3730型测序仪进行测序分析,测序结果显示连接正确。4将阳性克隆质粒抽提获得质粒pGCL-GFP-PIK3CA。5 XhoⅠ和SacⅡ酶切pEGFP-C1载体使其线性化,琼脂糖凝胶电泳结果显示酶切成功。提取的PIK3CA片段及酶切后的PIK3CA片段经琼脂糖凝胶电泳显示正确。6酶切后的PIK3CA片成功连接入酶切后的真核表达载体pEGFP-C1,通过PCR鉴定了阳性克隆,阳性克隆送测序显示PIK3CA基因克隆正确。7融合蛋白pEGFP-C1-PIK3CA转染293T细胞后,荧光显微镜下观察显示PIK3CA正确表达。8敲减质粒和表达质粒共转染293T细胞后,Western Blot检测PIK3CA表达水平结果显示3#即psc340靶点对PIK3CA有敲减作用。9将重组慢病毒载体pGCL-GFP-PIK3CA、包装质粒pHelper 1.0(gag/pol元件)载体和Helper 2.0(VSVG元件)载体三质粒共转染293T细胞后,收获病毒并测定病毒滴度为2×108 TU/ml。10 Real-time PCR检测慢病毒感染SKOV3后PIK3CA沉默效果。KD组PIK3CA基因相对含量为0.3303,明显低于CON组(1.1087)和NC组(1.1087),差异有统计学意义(P<0.01)。CON组和NC组间PIK3CA基因相对表达量无差别(P>0.05)。扩增产物溶解曲线显示,扩增途中没有出现杂峰,也未出现主峰的异常增宽,表明实验中未出现污染、引物二聚体和非特异性扩增。提示RNA干扰PIK3CA基因表达后,基因得到了稳定、长期抑制。11 MTT法检测细胞生长状况CON组及NC组细胞体外生长速度无明显差异(P>0.05),生长趋势基本一致,而KD组细胞生长速度明显慢于CON及NC组细胞,差异有统计学意义(P<0.01)。可见抑制PIK3CA基因表达的细胞生长速度明显减慢。提示PIK3CA基因的表达受抑制对SKOV3细胞的生长有明显的抑制作用。12流式细胞仪检测自发凋亡率和细胞周期的变化三组细胞经过流式细胞仪检测,KD组凋亡率为3.877%明显高于对照组CON组0.95%和NC组0.693%,差异有统计学意义(P<0.05)。KD组细胞G2/M期细胞数明显少于CON和NC组,S期细胞数明显大于CON和NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。而CON和NC组凋亡率和细胞周期无差异(P>0.05)。提示慢病毒感染SKOV3后通过降调PIK3CA表达,使细胞G2/M期细胞数减少,S期细胞数比例增加,可能是使细胞周期阻滞于S期。结论:1慢病毒可能是携带siRNA进入卵巢癌细胞的理想载体。2 RNAi慢病毒转染细胞后,PIK3CA在mRNA及蛋白水平被显著、持久沉默。3 PIK3CA基因对卵巢癌细胞SKOV3的生长和增殖有明显的调节作用。4干扰PIK3CA能提高卵巢癌细胞SKOV3凋亡率,使细胞G2/M期细胞数减少,S期细胞数比例增加,可能是使细胞周期阻滞于S期。