研究背景阿尔兹海默病(AD)是一种起病隐匿且慢性进行性发展的神经系统退行性疾病,以记忆力下降和认知功能障碍为主要临床表现。如今AD已成为老年人痴呆最常见的病因,并随着我国老龄化程度的加剧和日益增高的发病率,逐渐成为继心血管病、肿瘤与脑卒中之后威胁老年人健康的第四大杀手[1],给社会和家庭带来沉重的负担,因此如何遏制AD的发生发展成为亟待解决的问题。己知AD主要病理改变是细胞外老年斑沉积,细胞内神经原纤维缠结及脑内慢性炎症[2]。p淀粉样蛋白(Beta amyloid protein,Aβ)是由β分泌酶(βsecretion enzyme, BACE1)等水解淀粉样前体蛋白(amyloid precusor protein,APP)而产生的一种非特异性结合蛋白。近年研究显示,Ap不仅能聚集参与AD特征性病理改变即老年斑的形成,而且在早期能与晚期糖基化终末产物受体(RAGE)结合[3],激活相应的细胞内信号通路,进而引发神经元毒性、氧化应激与炎性等级联反应,成为各种原因诱发AD的共同通路,参与不同阶段的神经损伤,最终导致记忆等认知方面的下降[4,5]。因此Ap是AD形成和发展的关键因素,减少Ap的生成有希望成为阻断AD进程的有效手段。糖基化终产物((advaneed glycation end products,AGEs)是蛋白质的氨基与还原糖的羰基在无酶不可逆条件下形成的不溶性聚合物,高糖状态及老龄人体内AGEs增加。近年来有大量研究证据表明,AGEs参与糖尿病中(肾、脑、足、视网膜及骨等)各种靶器官的损害[6,7]。研究亦表明2型糖尿病是AD发生的危险因素之一,AD可能与糖尿病一样,是一种内分泌紊乱导致的代谢性疾病[8]。Carvalh发现糖尿病大鼠皮层和海马区Ap明显增多,并且在AD动物模型中,早期老年斑周围也均有AGES表达[9],说明AGEs,糖尿病及AD三者之间有着密切的联系。不仅如此,研究者发现随着AD动物模型病程的进展,AGES与Ap均聚集逐渐增多[1o],进一步提示AGES是导致AD病理改变的主要因素之一,且贯穿于AD病程始末。糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation endproducts,RAGE)是AGEs和Ap的共同受体,广泛存在于中枢神经系统的细胞膜上,在AD患者脑中高表达。RAGE能介导Ap通过血脑屏障(blood brain barrier,BBB)加剧Ap的聚集和神经纤维的缠结,并通过与其配体AGES或Aβ结合活化小胶质细胞从而引发炎症反应,导致炎症因子正反馈上调RAGE的自身表达,形成恶性循环,使神经损伤进一步扩大[1l]。目前已有研究证实,RAGE与其配体AGES结合引起的一系列反应是导致糖尿病脑损害和AD发生血管病变及认知障碍的共同通路,同时AGEs也在衰老中起重要作用。因此阻断RAGE与AGES的结合,可能会在很大程度上遏制上述疾病尤其是AD的进展。上述研究提示RAGE可能是治疗AD的有效靶点。当前阻断RAGE的手段主要有RAGE抗体及sRAGE,且体内体外实验均取得一定效果,但由于二者皆不能通过BBB作用于脑内的RAGE来干扰AGES的代谢,因此迄今为止仍无有效抑制RAGE的方法[12,13]。此外,目前的治疗AD药物临床疗效并不十分理想[1]。新近研发的RAGE阻断剂(PF-04494700)在临床前期实验的确能改善AD症状,但由于毒副作用太大而停用[14]。因此,研发既能通过血脑屏障又安全高效的RAGE阻断药物,具有更重要的意义。FPS-ZM1是由Deane等首次人工合成的无毒性RAGE特异性阻断剂。通过用FPS-ZM1干预APP转基因小鼠发现,该药能通过血脑屏障作用于脑内RAGE,从而阻断RAGE与Ap的结合引发的炎性反应,并能阻断外周Ap与血脑屏障上的RAGE结合进入中枢,因此该药可能成为理想的阻断RAGE的新药物[15]。已知AGEs-RAGE是参与AD发生发展的重要因素,FPS-ZM1对RAGE介导的多条损伤通路有较强的抑制作用。已有研究证明FPS-ZM1对APP转基因AD模型有明显神经保护作用,然而,FPS-ZM1是否对AGES诱导的脑神经损伤有保护作用未见报道。因此,我们设计该课题,通过建立AGES脑损伤动物模型,进一步研究AGEs-RAGE通路的脑损伤机制及FPS-ZM1阻断RAGE的脑保护效果和可能机制。目的(1)明确AGEs损伤机制,探讨不同损伤通路之间可能的联系。(2)探讨FPS-ZM1对AGES脑损伤所致海马区Aβ异常代谢的影响。(3)探讨FPS-ZM1对AGES脑损伤所致海马区炎性反应的作用机制。研究方法(1)建立AGEs脑损伤模型,大鼠麻醉后固定于立体定位仪上,常规备皮消毒,于颅顶部正中切开皮肤。参考Miguel-Hidalg等[12]的方法,用微量注射泵海马注射法,两侧海马内注射AGEs各5μ1,建立AGEs脑损伤模型。(2)分组及造模：将40只大鼠随机分4组(每组各10只)：a.生理盐水组(NC组)：海马内注射生理盐水。b.FPS-ZM1对照组：海马内注射生理盐水。c.AGEs组：海马内注射AGEs。d.FPS-ZM1组：海马内注射AGEso(3)干预方法：FPS-ZM1组和FPS-ZM1对照组：造模前1周以1mg/kg/d注射FPS-ZM1,并连续4周给药；AGEs组、NC组：腹腔注射相同体积生理盐水。(4)观察指标及检测方法：造模3周后进行Morris水迷宫实验,在测试期记录每次找到平台的时间(escape latency, EL)。水迷宫测试完成后,用免疫组化检测各组大鼠海马TNFα的蛋白表达,通过Western blot半定量检测各组大鼠海马区RAGE,β分泌酶、p-NF-κB和TNFα的表达,用ELISA法定量检测各组大鼠海马区Aβ1-40, Aβ1-42的表达。结果(1) Morris水迷宫实验AGES组逃避潜伏期较NC组、FPS-ZM1对照组明显延长(P<0.01),FPS-ZM1组逃避潜伏期较AGEs组明显缩短(P<0.01), FPS-ZM1组逃避潜伏期较NC组、FPS-ZM1对照组无明显改变(P>0.05)。(2)免疫组化检测大鼠海马区TNFa的表达与其他各组比较,AGEs组大鼠海马组织可见TNFa蛋白呈棕褐色阳性表达,着色最深；FPS——ZM1组免疫反应阳性细胞数少,染色浅；NC组、FPS——ZM1对照组海马区几乎没有阳性表达,且较AGES组和FPS-ZM1组细胞排列紧密,细胞无明显萎缩现象。(3)Western blot半定量检测各组大鼠海马区RAGE、GD11b, pNF-KB.TNFa和p分泌酶、APP的表达AGEs组RAGE、CD11b, pNF-KB.TNFa和β分泌酶、APP的表达明显高于NC组.FPS-ZM1对照组(P<0.01)；与AGES组比较,FPS-ZM1组上述指标表达明显降低(P<0.01)；与NC组.FPS-ZM1对照组比较,FPS-ZM1组RAGE表达无明显差异(P>0.05),但除RAGE外其他指标表达增强(P<0.01)。(4)用Elisa检测各组大鼠海马区Ap1-40,Aβ1-42AGEs组海马区Ap1-40和Ap1-42的浓度均较NC组、FPS-ZMl对照组明显增高(P<0.01)；与AGEs组,FPS-ZM1组Aβ1-40和Ap1-42的浓度明显降低(P<0.01),与NC组、FPS-ZM1对照组比较,FPS-ZM1组Ap1-40和Aβ1-42的浓度升高(P<0.01)结论(1)AGES能通过诱导海马区糖基化终末产物受体(RAGE)的高表达,上调P-NF-κB并可能激活BACE1,促进Aβ1-40Ap1-42生成增加。(2)RAGE受体阻断剂FPS-ZM1能通过阻断细胞上RAGE,减少脑组织NF-κB的激活,从而减轻脑AGES损伤引起的炎性反应。(3)FPS-ZM1可能通过抑制细胞上RAGE,下调p-NF-κB,进而降低BACE1的活性和APP蛋白水平,最终减少Aβ1-40,Aβ1-42生成,改善AGES脑损伤大鼠的认知水平。该实验证实FPS-ZM1能减少Ap生成并有抗炎作用,提示其脑保护的多效性,为今后该药的防治AD提供有利理论依据。该药可能将成为抑制阿尔茨海默病的有效措施。意义本实验通过应用脑立体定位技术建立大鼠AGEs海马损伤模型,证实AGEs-RAGE通路能通过上调P-NF-κB并激活BACE1,促进Aβ生成增加,且RAGE阻断剂FPS-ZM1能抑制AGEs模型组海马区Ap生成及炎症反应,进一步证实AGE-RAGE通路是参与AD发生发展的重要因素,验证了RAGE是治疗AD的有效靶点,FPS-ZM1可能成为具有潜力的防治AD的药物。