论文部分内容阅读
前言:糖原作为葡萄糖的初级储存单位对维持生物体的能量稳态具有重要的意义,糖原代谢的异常可以导致包括糖原累积病、糖原性肝病和非酒精性脂肪肝在内的多种肝脏代谢性疾病。近年来,随着肿瘤代谢重编程研究的不断深入,肿瘤细胞中的糖原代谢重编程逐渐引起了人们的注意:在肿瘤细胞和组织中发现了过度累积的糖原并且与增殖速度呈负相关。既往研究表明,癌基因(如MYC、PI3K/Akt等)和抑癌基因(如P53,LKB1/AMPK等)可以通过对影响其他代谢通路间接调控糖原代谢;肿瘤细胞中的缺氧环境也可以通过激活HIF1α提高糖原代谢酶的转录水平加速细胞糖原的合成继而导致糖原的累积。然而,无论对正常组织还是肿瘤细胞,糖原代谢异常的分子调控机制以及其在疾病发生发展中的作用尚不明确,有待于进一步研究。糖原分流(glycogen shunt)是首次在肌肉和脑组织中发现的一种代谢方式,即细胞摄取的葡萄糖会分流一部分用于糖原的合成,当细胞面临压力应激和营养改变时,储存的糖原可以分解并与其他代谢通路偶联以满足细胞对多种物质的需要。糖原代谢不仅仅发挥贮存葡萄糖的作用,而且可以通过糖原分流的形式完成葡萄糖在糖原代谢与糖酵解、磷酸戊糖和糖异生等多个代谢途径的重分布。在肿瘤细胞中,糖原分流也发挥着与正常组织类似的作用。大量研究表明糖原分流可以通过改变肿瘤增殖和侵袭关键细胞的糖酵解稳态来影响肿瘤生长和转移。然而,糖原分流的调控机制尚不明确。Favaro等人在研究中发现缺氧诱导的肿瘤细胞可以通过激活HIF1α通路在糖原合成加速后提高肝型糖原磷酸化酶的表达水平从而促进糖原的分流,然而这种依赖于HIF1α的调控机制很难全面地解释脑组织和一些肿瘤细胞在葡萄糖充足的情况下仍通过糖原分流满足机体对物质和能量的需要。MYCT1(c-Myc target 1),作为c-Myc的靶基因,可以涵盖多种c-Myc的生理病理表型,具有促进多种肿瘤细胞凋亡、促进细胞分化、抑制细胞侵袭迁移等多种功能。本课题组前期为了探索喉癌细胞中MYCT1分子作用机制,构建了Myct1基因敲除鼠,意外地发现Myct1基因敲除小鼠出现了肝脏糖原代谢的异常,这与本课题组MYCT1稳转喉癌细胞iTRAQ定量蛋白组学的结果类似,即上调MYCT1可以增加多个糖原代谢酶(PGM1、GSK3A及UGP2)的蛋白表达水平,上述结果提示MYCT1可能参与了糖原代谢的调控。此外,在研究MYCT1互作蛋白时,针对稳转MYCT1的肿瘤细胞进行了免疫沉淀蛋白质谱检测,功能富集分析和信号通路富集分析发现高丰度的参与蛋白翻译调控的功能分子,并发现了一个翻译调控相关分子,即活性蛋白激酶C受体1(receptor for activated C kinase1,RACK1),RACK1 是真核生物核糖体 40S 小亚基头部的支架蛋白,能够与多种信号转导分子、翻译辅助因子和RNA结合蛋白相互作用,调控蛋白翻译水平,而且其在核糖体上的富集程度直接影响特定mRNA的翻译效率。在以酵母为模型的相关研究中研究者发现RACK1的同源蛋白Cqc2/Asc1敲除后不仅会显著降低蛋白翻译的整体水平,同时还可以调控代谢相关分子的翻译水平,上述研究结果提示MYCT1可能与RACK1共同参与了糖原代谢酶翻译水平的调控,并可能通过MYCT1/RACK1互作达到选择性翻译调控的作用。本研究拟从MYCT1与RACK1相互作用调节糖原代谢酶的选择性翻译入手,探索MYCT1-RACK1对糖原代谢酶翻译水平的影响以及其在糖原分流中的分子作用机制。材料与方法:1.实验材料:Myct1基因敲除型和野生型(C57BL/6),人正常肝细胞系LO2、人肝癌HepG2及HuH7细胞系。2.实验方法:CRISPR/Cas9,Western blot,Sanger测序,石蜡包埋组织切片,HE染色,PAS染色,透射电镜,细胞培养,瞬时转染,慢病毒稳转技术,实时荧光定量PCR,蔗糖密度梯度离心,比色法,ELISA,免疫共沉淀技术,免疫荧光,多聚核糖体分析。结果:1.应用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除鼠,对Myct1基因敲除鼠的组织分别提取DNA、RNA和蛋白。经过Sanger测序验证,构建的Myct1基因敲除鼠在Myct1基因第二外显子功能结构域中存在8个碱基的缺失致移码突变,经生物信息学预测,突变后蛋白已失去了原有功能结构域。经Western blot检测验证小鼠肝脏组织中无完整鼠源MYCT1蛋白产生,即小鼠肝脏组织中鼠源MYCT1缺失。2.记录小鼠生长曲线、计算各年龄段内脏指数以及检测小鼠空腹血糖、糖耐量。结果表明:Myct1基因敲除鼠体重逐渐高于野生型对照组(n=38);200天Myct1基因敲除鼠肝脏的内脏指数显著增高(P<0.05),300~400天Myct1基因敲除鼠肝脏的内脏指数显著降低(P<0.05);Myct1基因敲除鼠空腹血糖显著低于同窝野生鼠(P<0.05),糖耐量2小时血糖显著高于同窝野生鼠(P<0.05)。3.小鼠肝脏石蜡包埋切片HE染色、PAS染色和透射电镜的检测。结果表明:Myct1基因敲除鼠肝脏存在着随年龄逐渐加重的细胞损伤和糖原累积;透射电镜结果显示在Myct1基因敲除鼠肝脏细胞中出现大量糖原物质的累积,内质网断裂。4.应用RT-qPCR和Western blot检测糖原代谢酶mRNA和蛋白的表达水平。结果显示:Myct1基因敲除鼠较同窝野生鼠糖原代谢酶Pgm1、Ugp2、Gsk3a转录下降水平低于10%或无统计学意义;100天、200天及300天的Myct1基因敲除鼠糖原代谢酶PGM1蛋白水平分别下降34%(P<0.05)、42%(P<0.05)、43%(P<0.05),UGP2 蛋白水平分别下降 30%(P<0.05)、39%(P<0.05)、42%(P<0.05),GSK3A 蛋白水平分别下降 27%(P<0.05)、38%(P<0.05)、50%(P<0.05)。5.应用蔗糖密度超速离心分离小鼠肝脏组织中的核糖体mRNA复合物,荧光定量PCR检测糖原代谢酶的翻译效率。结果表明:Myct1基因敲除鼠的糖原代谢酶翻译效率较野生型显著下降,Pgm1下降51%(P<0.05),Ugp2下降39%(P<0.05),Gsk3a下降 27%(P<0.05)。6.应用比色法检测试剂盒和ELISA对小鼠肝脏组织进行糖原代谢产物检测。结果表明:与同窝野生型相比,Myct1基因敲除鼠随年龄增长肝脏组织中的糖原和G1P含量显著增高(P<0.05),G6P和UDPG显著降低(P<0.05)。7.应用Western blot检测三种细胞(HepG2、Huh7和LO2)过表达MYCT1和敲减MYCT1的细胞中糖原代谢酶的蛋白表达水平。结果表明:MYCT1显著提高糖原代谢酶的蛋白表达水平(P<0.05)。8.应用G1P、G6P和糖原比色法检测试剂盒和人UDPG ELISA检测试剂盒检测过表达MYCT1和敲减MYCT1的细胞中糖原代谢产物的含量。结果表明:MYCT1降低了细胞中糖原和G1P的含量(P<0.05),提高了细胞中G6P和UDPG的含量(P<0.05),调控了肿瘤细胞的糖原分流。9.构建肝癌细胞HepG2的MYCT1慢病毒稳转细胞系,应用Western Blot检测糖原代谢酶的蛋白表达水平,应用蔗糖密度超速离心技术分离细胞中的核糖体mRNA复合物联合实时荧光定量PCR检测糖原代谢酶转录水平和翻译效率。结果表明:MYCT1对糖原代谢酶转录水平没有影响,可以提高糖原代谢酶的翻译效率和蛋白水平(P<0.05)。10.高糖刺激慢病毒稳转MYCT1的肝癌细胞HepG2及其对照,应用G1P、G6P、糖原比色法检测试剂盒和人UDPG ELISA检测试剂盒检测糖原代谢产物含量,记录0、1、3、6、12、24h糖原代谢产物含量。结果表明,过表达MYCT1后糖原合成速率和含量明显下降,UDPG和G6P速率和含量明显增加,进一步证实MYCT1调控了肿瘤细胞的糖原分流。11.应用TCGA数据库分析MYCT1在膀胱癌、乳腺癌、食管癌、胶质瘤、头颈部肿瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞癌、卵巢癌、胃癌、肾透明细胞癌和肾乳头状细胞癌中的表达情况,比较糖原富集肿瘤和非糖原富集肿瘤中的MYCT1表达情况。结果表明:MYCT1在糖原富集肿瘤中高表达。12.应用免疫共沉淀技术和免疫荧光技术证实在小鼠肝脏组织和人肝癌细胞中MYCT1与RACK1蛋白分子的生物结合及相同的亚细胞定位,明确了 MYCT1与RACK 1的相互作用。13.应用多聚核糖体分析联合Western blot检测小鼠肝脏组织和慢病毒稳转MYCT1的人肝癌细胞HepG2中核糖体上RACK1的富集情况。结果表明,Myct1基因敲除鼠肝脏组织中核糖体上RACK1蛋白显著减少;人肝癌细胞HepG2中过表达MYCT1后核糖体上RACK1蛋白显著增多,证实了 MYCT1影响RACK1在核糖体上的富集程度。14.应用免疫共沉淀技术和免疫荧光技术检测人肝癌细胞HepG2的MYCT1慢病毒稳转细胞中RACK1与RPS3的结合情况。结果表明,过表达MYCT1后,RACK1与RPS3的结合率显著升高,进一步证明了 MYCT1影响RACK1在核糖体上的富集程度。15.应用Western blot检测慢病毒稳转MYCT1的HepG2细胞、敲减RACK1的HepG2细胞和敲减RACK1慢病毒稳转MYCT1的HepG2细胞中糖原代谢酶的蛋白表达水平。结果表明:慢病毒稳转MYCT1后,糖原代谢酶蛋白水平显著提高(P<0.05);RACK1敲减后糖原代谢酶蛋白水平显著下降(P<0.05);RACK1敲减能够阻断MYCT1对糖原代谢酶的调控作用,明确了 RACK1对糖原代谢酶的调控作用及RACK1介导MYCT1对糖原代谢酶的调控作用。16.应用蔗糖密度超速离心技术分离慢病毒稳转MYCT1的HepG2细胞、敲减RACK1的HepG2细胞和敲减RACK1慢病毒稳转MYCT1的HepG2细胞中的核糖体mRNA复合物,实时荧光定量PCR检测糖原代谢酶的翻译水平。结果表明:慢病毒稳转MYCT1可以显著提高糖原代谢酶的翻译效率(P<0.05);敲减RACK1可以降低糖原代谢酶的翻译效率(P<0.05);敲减RACK1可以阻断MYCT1对糖原代谢酶翻译效率的提高(P<0.05),MYCT1可以减弱RACK1对糖原代谢酶翻译效率的负调控作用(P<0.05),明确了 RACK1对糖原代谢酶的翻译调控作用及RACK1介导MYCT1对糖原代谢酶的翻译调控作用。17.应用G1P、G6P、糖原比色法检测试剂盒和人UDP葡萄糖ELISA检测试剂盒检测慢病毒稳转MYCT1的HepG2细胞、敲减RACK1的HepG2细胞和敲减RACK1慢病毒稳转MYCT1的HepG2细胞中糖原代谢产物含量。结果表明:慢病毒稳转MYCT1减少了糖原和G1P的含量,增加了 G6P和UDPG的含量(P<0.05);RACK1敲减后糖原和G1P含量显著增加(P<0.05),G6P和UDPG含量显著减少(P<0.05),RACK1敲除能阻断MYCT1对糖原代谢产物的调控作用,MYCT1能够回复RACK1对糖原代谢产物的调控作用,明确了 RACK1对糖原分流的调控作用及RACK1介导MYCT1对糖原分流的调控作用。结论:1.成功构建Myct1基因敲除小鼠,并在基因组、转录及蛋白水平验证了小鼠肝脏组织MYCT1缺失。2.MYCT1能够调控糖原代谢并且通过调控糖原代谢酶PGM1、UGP2和GSK3A的表达水平维持糖原代谢的稳态,起到“糖原分流器”的重要作用。3.MYCT1能够调控肿瘤细胞的糖原分流,在不同糖原代谢类型的肿瘤发挥不同的作用,对肿瘤代谢重编程具有重要的意义。4.MYCT1可以与RACK1互作并通过影响RACK1在核糖体上的富集来调控糖原代谢酶PGM1、UGP2和GSK3A的翻译效率,共同调控肿瘤糖原分流。