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实验室利用农杆菌介导遗传转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation; ATMT)技术,构建了灰葡萄孢的T-DNA插入突变体库。通过筛选该ATMT突变体库,获得了一株不产生菌核的突变体BCt41,利用TAIL-PCR、PCR、 Southern blotting、RT-PCR等技术,确定了其突变基因为编码一个功能未知的假定蛋白BcADR1。为进一步明确BcADR1基因在灰葡萄孢生长发育和致病过程中的功能及其调控机制,本研究利用RT-PCR和Real-time PCR技术,对BcADR1基因的表达规律进行分析；利用基因互补回复技术,构建了BcADR1基因的互补回复突变体BCt41/BcADR1;通过对野生型BC22、突变体BCt41和回复突变体BCt41/BcADR1的表型和致病力分析,确定了BcADR1基因对病菌生长发育和致病力的调控功能。通过对野生型BC22、T-DNA插入突变体BCt41和回复突变体BCt41/BcADR1的胞壁降解酶活性、毒素活性、产酸能力、穿透能力和附着胞形成、致病相关基因的表达、响应逆境胁迫的能力等进行分析,探讨BcADR1基因调控病菌生长、发育及致病力的机制。为阐明灰葡萄孢的生长、发育和致病力的调控机制奠定基础。1.利用RT-PCR和Real-time PCR技术,检测野生型BC22的菌丝、分生孢子和菌核中BcADR1基因的表达水平。结果发现,BcADR1基因在病菌菌丝中的表达水平较高,而在分生孢子和菌核中未检测到该基因的表达。2.构建了BcADR1基因的互补回复载体pBARKS1-BcADRl-GFP,利用PEG介导的遗传转化技术转化T-DNA插入突变体BCt41的原生质体,利用草胺膦筛选转化子,通过PCR、Southern blotting和Real-Time PCR等技术对所获得转化子进行鉴定。确定了所获得的草胺膦抗性转化子为BcADR1的互补回复突变体BCt41/BcADR1。3.以灰葡萄孢野生型菌株(BC22)为对照,对T-DNA插入突变体BCt41和回复突变体(BCt411/BcADRl)进行表型和致病力分析,发现BCt41的生长速率较野生型和回复突变体明显减慢,菌丝纤细、颜色浅,不产生菌核,产孢量明显增强,细胞壁较厚、且胞外分泌物；且BCt41的致病力明显减弱。表明BcADR1正调控灰葡萄孢的菌核产生、菌丝生长和致病力,负调控灰葡萄孢分生孢子的形成。4.与野生型BC22和回复突变体(BCt41/BcADR1)相比,T-DNA插入突变体BCt41的果胶甲基反式消除酶(PMTE)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)、纤维素酶(Cx)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)和乳糖醛酸酶(PG)的活性明显降低。突变体BCt41的毒素活性较野生型和回复突变体明显降低；产酸能力明显减弱。表明BcADR1突变影响灰葡萄孢胞壁降解酶活性、毒素活性、产酸能力。5.对野生型BC22、T-DNA插入突变体BCt41和回复突变体(BCt41/BcADR1)的穿透能力和附着胞形成进行分析,发现3个菌株均能穿透玻璃纸,在PDA培养基上产生菌落；而突变体BCt41产生的附着胞与野生型和回复突变体明显不同。表明BcADRl突变影响灰葡萄孢附着胞的形成、但不影响其穿透能力。6.利用Real-time PCR技术,检测野生型BC22、T-DNA插入突变体BCt41和回复突变体BCt41/BcADRl中致病相关基因的表达水平。发现BCt41突变体中Bcg2、 BcReg1、PkaR、Bac、Bcp1、Bmp1、Bcg3、Sod1和Bosl基因表达水平较野生型和回复突变体明显增强。表明灰葡萄孢BcADRl负调控这些致病相关基因的表达。7.检测野生型BC22、T-DNA插入突变体BCt41和回复突变体BCt411/BcADRl对NaCl、KCl、氟康挫和CFW的敏感性,结果发现T-DNA插入突变体BCt41在NaCl、KCl的培养基上生长速率较野生型和回复突变体明显降低；BCt41突变体在氟康挫和CFW的培养基上明显受到抑制。表明BcADR1基因参与调控灰葡萄孢响应渗透胁迫反应及其细胞壁和细胞膜的形成。