目的:多重耐药铜绿假单胞菌现今已经成为临床上的严重威胁,头孢他啶-阿维巴坦作为一种新型抗生素,在治疗多重耐药铜绿假单胞菌上具有独特的优势。但临床上已经出现了对头孢他啶-阿维巴坦耐药的铜绿假单胞菌,目前对其耐药详细机制仍不够明确。本研究前期从临床筛选出了1株产KPC-90铜绿假单胞菌,探索其对头孢他啶-阿维巴坦的耐药机制,为针对其进一步的临床防治提供理论基础。方法:选取前期临床上分离的碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌（Carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa,CRPA）762株,采用美国临床和实验室标准协会（Clinical Laboratory Standards Institute,CLSI）推荐的微量肉汤稀释法测定了头孢他啶-阿维巴坦最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentrations,MICs）;对头孢他啶-阿维巴坦耐药菌株利用聚合酶链式反应技术（Polymerase Chain Reaction,PCR）进行常见耐药基因筛查,包括bla KPC、bla VIM、、bla NDM、bla IMP、bla OXA;对菌株相关的临床信息进行收集与整理;采用多位点序列分型（Multilocus Sequence Typing,MLST）技术对菌株进行克隆分型;应用酶切克隆结合药敏试验验证耐药基因介导头孢他啶-阿维巴坦耐药表型;通过质粒接合转移实验,验证耐药基因是否可以水平转移;通过对菌株进行全基因组测序,明确菌株基因组特点;应用实时荧光聚合酶链式反应技术（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-q PCR）结合外排泵抑制实验,验证铜绿假单胞菌外排泵基因介导头孢他啶-阿维巴坦耐药产生的相关性。结果:在14株头孢他啶-阿维巴坦耐药CRPA中,筛选出一株携带bla KPC-2突变基因的铜绿假单胞菌PA2207,根据基因命名规则我们命名此突变基因为bla KPC-90。全基因组测序结果显示PA2207为ST463型,Opr D膜孔蛋白缺失突变导致其产生碳青霉烯耐药,其质粒上携带bla KPC-90基因。与bla KPC-2相比,bla KPC-90在第538-539对碱基之间的位置插入了6个核苷酸,导致Ω环区域外第180和181个氨基酸之间有两个氨基酸（酪氨酸和苏氨酸）的插入。bla KPC-90在大肠埃希菌DH5α中的克隆和表达证实了KPC-90可以导致头孢他啶-阿维巴坦的最低抑菌浓度（MIC）增加64倍,质粒接合转移实验进一步证实了bla KPC-90位于一个可转移的质粒上。全基因组序列分析表明,该质粒与先前临床流行的ST463型碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌P23上携带bla KPC-2的质粒p P23具有高度的序列相似性。此外,对外排泵基因表达水平的研究发现mex Y基因的表达升高了7倍,在加入外排泵抑制剂PaβN后,该铜绿假单胞菌头孢他啶-阿维巴坦的MIC值从512mg/L下降到了16mg/L。研究结果进一步证实铜绿假单胞菌PA2207外排泵系统mex Y基因的高表达也是导致该菌株对头孢他啶-阿维巴坦耐药的重要原因。结论:本研究首次报道了KPC蛋白Ω环区域外,酪氨酸和苏氨酸插入产生的新蛋白变体KPC-90介导临床ST463型铜绿假单胞菌对头孢他啶-阿维巴坦耐药发生的机制。此外,铜绿假单胞菌外排泵基因的高表达也会导致头孢他啶-阿维巴坦耐药发生。PA2207分离自长期使用抗生素的血液系统疾病患者,临床医生需要高度关注此类人群感染多重耐药菌的可能性,并采取措施防止多重耐药菌株的进一步播散。